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IVD前沿!这所名校揭示了抗体定向偶联新方法!

2019-7-11| 编辑: 小桔灯网| 查看: 1030| 评论: 0|来源: 生物医学知识局丨作者:Stenhen jennel

摘要: 在《抗体偶联技术从哪里创新?》一文中,曾提及过东南大学与南京东纳生物公司联合开发了一种简单的亲和偶联与化学偶联结合的方法,实现抗体定向包被在聚苯乙烯微球表面。近日,东南大学再度发表文章,揭示了一种更为 ...


 




在《抗体偶联技术从哪里创新?》一文中,曾提及过东南大学与南京东纳生物公司联合开发了一种简单的亲和偶联与化学偶联结合的方法,实现抗体定向包被在聚苯乙烯微球表面。近日,东南大学再度发表文章,揭示了一种更为简单的抗体定向偶联方法和机制。


在免疫学实验中,我们常常需要将抗体包被在固相表面,如96微孔板,胶体金颗粒,聚苯乙烯微球,或者磁性颗粒表面。传统的标记方法如物理吸附、共价偶联等是随机的将抗体偶联在固相表面。这种随机性容易导至抗体不定向的固定在固相表面,如Fab端朝下,倒立吸附;横躺在固相表面;Fc端朝下,立在固相表面。最后一种是抗体偶联最为理想的形式,可以充分保护抗原结合位点活性,减少空间位阻影响。


△抗体在固相表面的四种形式。来源:Biointerphases, 2017, 12(2): 02D301



东南大学新论文发表

揭示抗体抗体定向偶联方法与机制


近日,东南大学研究者再度与东纳生物在国际期刊Langmuir发表文章,揭示了通过调节pH,改善EDC/sulfo-NHS交联方法,实现抗体在羧基表面聚苯乙烯微球上的定向偶联。


研究者发现在抗体的Fab端,碱性氨基酸的数量要多于酸性氨基酸,意味着Fab端拥有更多的氨基;而在抗体的Fc端,两种氨基酸的数量分布更均匀,因此,Fab端的等电点要略高于Fc端的等电点。


因此,在不同的pH环境下,虽然抗体整体电荷为正或者为负,但是Fab端与Fc端的带电量可能会存在差异。通过亨德森 - 哈塞尔巴赫方程,从pH环境从4.8增加到8.8过程中,Fab端与Fc端电荷变化量是不一致的。从图2中曲线可以看到,当pH小于6.8时,Fab端与Fc端同时带正电荷,但是Fab端带电量要高于Fc端。当pH大于6.8,此时Fab端依然带正电,而Fc端开始带负电。因此,在抗体偶联或者标记过程中,不同的pH会导至抗体的电荷分布不一致,而影响抗体的偶联效果。


△抗体Fab端与Fc端随pH变化曲线。来源:Lou D, Ji L, Fan L, et al. Langmuir, 2019,35(14): 4860-4867


研究者通过在不同的pH条件下,采用EDC/NHS两步偶联方式,将鼠IgG1抗体偶联在羧基表面聚苯乙烯微球(PS)上。


研究发现,当处于pH7.8环境下,抗体Fab端带正电荷,此时Fc端带负电荷。而此时PS微球表面由于大量的羧基处于去质子化状态,带负电。因此抗体的Fab端将因为静电吸附作用优先与PS微球结合。另一方面,在pH7.8时,Fab端的终端氨基要比侧链赖氨酸上的氨基更容易去质子化(-NH3+脱去一个质子,形成NH2),去质子化的氨基更容易与活化的羧基反应。因此,在这种条件下,是不利于抗体Fc端与PS微球表面羧基结合,而导至抗体Fab朝下,即处于Head-on状态,失去与抗原结合的能力。


而当处于pH5.8的环境下,Fab端与Fc端都带正电,因此都有可能通过静电吸附,附着在PS微球表面。并且此时,Fab端的氨基也处于质子化状态(NH3+),反应优先级被降低。另外,Fc端虽然带正电荷,但是其带电量要明显低于Fab端,其水化层更薄,疏水性更强,更易于参与反应。最后,两步法反应中,第二步抗体偶联反应pH降低,NHS酯水解速度更慢,氨基-羧基的反应速度也较慢,为抗体在羧基表面调整方向提供了时间。


研究者通过抗Fc端抗体捕获包被在PS微球表面的Fc端含量,证实了这一理论。


△抗体表面偶联机制。图片来源Lou D, Ji L, Fan L, et al. Langmuir, 2019,35(14): 4860-4867


小结


虽然这一理论和实验看似简单,但是却为抗体的包被和标记提供了理论指导。我们国内大多数IVD企业都集中精力在产品研发上,而缺乏这样的时间和资源去研究这样简单的技术理论,导至许多研发人员知其然而不知其所以然,无法对产品研发和生产形成理论技术指导。这大概是产品之间存在质量差距的原因之一吧。同样,国内许多高校的基础研究处于技术前沿,无法短时间内对行业形成应用或者影响,导至产业与学术研究脱节。因此,看似简单的实验和理论,确实更“接地气”的研究。我们也希望会有更多的高校或者公司企业,能够有这样“接地气”的研究,指导我们的IVD企业更好的开发产品。


参考文献:Lou D, Ji L, Fan L, et al. Antibody-orientedstrategy and mechanism for the preparation of fluorescent nanoprobes for fastand sensitive immunodetection[J]. Langmuir, 2019, 35(14): 4860-4867.

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