张少华 刘毅 刘兵 江泽飞 ｛军事医学科学院附属医院乳腺肿瘤科（张少华、江泽飞）｝ ｛军事医学科学院附属医院肿瘤学研究室（刘毅、刘兵）｝ 肿瘤是异质性最明显的人类疾病。异质性包括时间和空间异质性，不同患者之间，甚至同一肿瘤的不同部位之间，以及同一患者不同治疗阶段，存在各不相同的生物学特征[1]，应该在治疗上区别对待。近年来，随着越来越多临床证据的出现，通过分子诊断来指导患者个体化的精准治疗，已逐渐成为肿瘤临床治疗的共识。 然而，在临床实践中，很多患者会由于种种原因而无法取得组织标本或者组织标本的质量不足以完成分子检测。著名的IPASS研究中，只有36%（437/1 217）的患者完成了表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）的突变检测[2]。此外，肿瘤的异质性是在不断发生变化的，虽然可以通过穿刺活检进行实时的分子分析，但毕竟为有创操作，且所获得的组织相对有限，其分子状态可能不一定反映整个肿瘤组织的全貌[3,4]。 在这样的背景之下，液体活检的概念被反复提及并迅速成为临床关注的焦点[5]。本文将对该领域的进展及其在精准医疗之中的应用作一综述。 所谓液体活检是指通过体液标本而进行的诊断分析。人体内广泛分布有各种液体，统称为体液，在健康的成年男性和女性中，其比例分别约为60%和55%。体液可以进一步分为细胞内液和细胞外液，细胞外液中，约有20%为外周血，其余为各种组织间隙液[6]。这些液体彼此之间不断发生各种物质的交换，其中可能存在肿瘤来源的核酸、蛋白及细胞，形成液体活检的基础。 相较于传统的组织活检，液体活检的主要优势是创伤较小，患者容易接受，非常方便进行实时动态监测。而且在液体状态下，各种肿瘤来源的成分相对均一，更容易从整体角度反映肿瘤在时间及空间上的异质性。目前，液体活检的主要临床应用方向包括：（1）癌症的早期筛查；（2）制定个体化治疗方案；（3）实时监测疗效和耐药；（4）判断转移风险；（5）指导研发新的靶向药物；（6）认识和了解肿瘤的异质性等[7]。但是，除了个别标志物用于制定个体化治疗方案已经得到广泛认可之外，上述其余方面的应用还需要积累更多的循证医学证据。 目前已经被报道用于液体活检的体液类型包括：外周血、疾病状态下的胸腹水和脑脊液、尿液及唾液等等。其中，外周血是目前应用最为广泛的液体活检标本。以外周血为例，可用于液体活检的主要材料为循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）和细胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）[8]，以下将对其分别进行介绍。 由于不具有细胞形态且片段较短，ctDNA能够充分地溶解于体液之中，在体内分布最为广泛，如果检测方法足够灵敏，就能够被检测到。这也是2016年美国临床肿瘤学会年会上有学者报告称唾液（Abstract 8520）和尿液（Abstract 9001）也可以用于液体活检的原因。 关于ctDNA，最典型的临床应用是检测肺癌的EGFR突变，已被明确写入相关药物的使用说明书。纵观近十年来该领域的相关研究，相较于组织学检测结果，ctDNA的特异度非常好，多数在95%以上；但灵敏度不甚理想，多数在80%以下[9]。如何保证阳性标本能够被有效检出，是采用ctDNA进行检测所必须面临的关键问题。 要分析其解决办法，需从ctDNA的特点入手。ctDNA包含了来自于肿瘤的突变的和未突变的DNA，由于其在外周血中的片段化比较严重，突变的DNA又可进一步分为可扩增和不可扩增2种类型。外周血中ctDNA的含量原本就少，可扩增的突变DNA自然就更少，如何保证这部分DNA的有效扩增和检测就尤为重要。 解决办法之一是采用更加灵敏的检测技术。代表性技术有微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）和二代测序（next generation sequencing，NGS）技术。ddPCR通过油滴法将目标DNA分散为成千上万个独立的反应体系，从而有效避免传统PCR过程中来自非突变DNA的干扰，灵敏度可达0.001%。另外，通过分析突变信号油滴在总有效油滴中的百分比，可以非常方便地了解突变DNA的相对含量[10,11]。利用以上技术优势，ddPCR在肺癌和乳腺癌患者病情的实时动态监测方面已有非常好的应用案例[12,13]。NGS技术的优势是能够一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，通过增加测序深度可使灵敏度达到0.01%甚至更高的水平，能够对结构变异、点突变、拷贝数变化、缺失、表达、融合及剪切体变异等遗传信息的改变进行分析[14]。尽管目前NGS的相关研究报道有很多，但其在临床实际应用中尚存在诸多问题。为此，中国临床肿瘤学会的中国肿瘤驱动基因分析联盟执行委员会于2016年初发布了《二代测序技术应用于临床肿瘤精准诊治的共识》，共9个方面36项声明，以期提高NGS技术临床应用的规范化和标准化。 ddPCR和NGS都是液体活检的代表性技术，前者的优势是简单快捷易操作，总价较低，但是一次只能检测一个已知突变；而后者虽然可以同时检测多个未知突变，但是操作及分析繁琐，且总价较高。不难看出，这两项技术其实各有优缺点，彼此可以互补。如果在临床的实际应用过程中，将两种方法结合起来使用，则有望为患者的个体化治疗提供更有价值的指导（图1）。
图1 微滴式数字PCR（ddPCR）和二代测序（NGS）联合使用进行肿瘤患者个体化治疗的流程图 解决办法之二是增加肿瘤来源核酸的含量，这在某种程度上可以降低对检测方法灵敏度的依赖。比较直接的策略是尽量选择偏晚期的患者或加大用于DNA提取的初始血液体积。此外，还有一种策略就是采用CTC进行检测。 CTC是指从肿瘤组织脱离并进入血液循环系统的肿瘤细胞，CTC的产生是患者发生远处转移的必要条件[15]。CTC不仅是重要的预后指标，还被认为是非常有效的实时活检工具，是了解肿瘤细胞内部致病分子机制及耐药机制的窗口[16]。 以EGFR突变检测为例，Maheswaran等[17]和Sundaresan等[18]的研究结果均显示，相较于ctDNA，CTC的检测结果与组织学结果更符合。造成这一结果的重要原因之一是检测到CTC即可确认肿瘤来源核酸的存在，其中可扩增的突变DNA含量相对集中，在检测方法一致的前提下，CTC的灵敏度自然就更高。这也意味着，由于很难确定检测样本中有无ctDNA或其含量是否满足检测方法的灵敏度下限，在ctDNA检测结果为阴性时需警惕假阴性可能。 除了肿瘤来源核酸的相对含量较高之外，CTC相较于ctDNA还有一个重要的优势就是具有完整的细胞形态，甚至某些CTC还具有生物功能活性。因此，CTC可以进行包括蛋白质组、转录组及基因组等在内的最完整的遗传信息分析，同时还可以进行形态学及细胞培养、动物体内实验等功能性研究。相较而言，由于不具有细胞形态且以片段化的形式存在，ctDNA一般相对局限于点突变、表观遗传改变及易位等基因异常的检测[19]。 以乳腺癌的人类表皮生长因子受体2（human epithelial growth factor receptor-2，HER2）为例，临床常规推荐使用荧光染色体原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）和免疫组化进行检测，二者都需要从细胞的整体进行分析，CTC在这方面无疑比ctDNA更具优势，也一直是临床关注的焦点。然而，既往关于CTC检测HER2的研究在方法学上并不一致，CTC HER2阳性的定义也各不相同，使这些研究之间难有可比性。结合既往研究结果，我们提出将>30%的CTC表达强阳性的HER2信号作为CTC HER2的阳性标准；按照这一标准，即使同为组织学HER2阳性，但只有CTC HER2阳性的患者才能真正从抗HER2治疗中获益，而且患者组织学HER2末次检测距离CTC检测的时间越长，两者不一致的可能性越大，从而进一步证实了通过CTC进行HER2实时检测的必要性[20,21]。相较而言，欧美学者更为关注组织学HER2阴性的患者，目前德国进行的DETECT Ⅲ研究及法国进行的CirCe XXX1研究都是期望通过CTC的HER2检测，进一步筛选出能够从抗HER2靶向药物中获益的患者。上述研究的结果将从另一个侧面证实CTC的实时分子分型对疗效的预测价值[22]。 除了HER2的免疫荧光或FISH检测之外，CTC还可以进行ddPCR、NGS、基因芯片、细胞培养及药物筛选等工作，从而为患者的个体化治疗提供更加全面的信息[23,24]。但是，上述分析对CTC的数量、质量及活性都有较高的要求，目前唯一通过美国FDA和中国CFDA批准的CellSearch®系统在这些方面很难胜任，这在某种程度上促进了CTC检测分析技术的飞速发展[25]。 新一代CTC技术中，较为知名的包括：（1）美国哈佛大学Haber团队的iChip技术：先利用微柱根据细胞大小进行分选，然后再利用CD45进行阴性选择[26]，目前在单细胞实时克隆分型指导治疗方案调整[27]、体外培养CTC用于个体化药物敏感性实验[28]及对肿瘤转移机制的深入了解[29]等方面均显示出了很好的应用价值；（2）加州大学洛杉矶分校的纳米粘扣芯片：通过芯片表面纳米毛样的结构来增强细胞的捕获效果，芯片表面还可以进行多种化学修饰，通过温度调节即可实现CTC的捕获和释放[30,31]，尤其在肺癌中显示了较好的检出效果[32,33]；（3）采用滤膜根据细胞大小进行富集的ISET法：在进行免疫组化或FISH等原位检测时非常有优势[34]；（4）根据流体力学原理的惯性芯片技术[35,36]：由于不需要做细胞标记，富集的CTC可能更适合下游的分子分析和培养；（5）CellCollector技术：类似采血针的装置，在体内即可实现CTC的富集，从而不受采血量的限制[37,38]。除了以上几种代表性技术外，目前检测CTC的技术还有很多种，国际和国内的相关公司至少有几十个，篇幅所限，不再逐一介绍。如此多的厂家和方法，的确在一定程度上反映了学界对于CTC在指导个体化治疗及认识肿瘤耐药和转移机制方面的巨大应用前景的认可。遗憾的是，除了CellSearch®技术之外，目前尚无其他技术真正获准可以用于临床常规检测，现有的技术都还有待多中心、大样本量的临床试验的验证。 EV的形成是细胞影响其周围环境的一种方式，根据其大小及形成的具体方式可以分为两大类：直径为50～150 nm，以多泡体融合而形成的是外泌体；直径为100～1 000 nm，从细胞膜脱落的是微泡。目前认为，EV在肿瘤微环境调控及远处转移等方面均具有非常重要的作用[39,40]。 实验室中获得EV通常是采用差速离心法。此外，也可以通过一些已知的膜蛋白对EV进行富集和检测。外泌体和微泡上的特征性膜蛋白有所不同，内容物也各有差别，但是总体可以分为蛋白、RNA、miRNA及脂类[39,40]。虽然目前已经有了很多这方面的研究报道，但是关于这些物质在肿瘤发生发展过程中的具体作用，以及它们作为分子标志物的意义和价值，目前还尚不明确，仍有待进一步的探索和研究。 采用EV进行液体活检，正在成为继ctDNA和CTC之后，另外一个蓬勃兴起的研究领域。 综上所述，分子诊断对肿瘤的个体化精准治疗具有重大的意义。不管是组织活检，还是用于液体活检的ctDNA、CTC和EV，尽管它们各具优缺点，但是从本质上来说，都是获取肿瘤遗传物质进行分子诊断，彼此之间不应排斥或对立，而应互为补充，从各个不同的时间、空间和角度来反映肿瘤的特性。很显然，对肿瘤分子特征了解越准确、越全面，由此而制定的治疗策略就将更有针对性和更精准。 然而，肿瘤异质性不断变化的特点及组织标本不易获取的现实使液体活检的作用和价值越来越凸显。相信未来随着液体活检相关技术的不断完善和发展，液体活检将会在肿瘤个体化精准医疗中发挥越来越重要的作用。 （参考文献略） |
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