跟着大佬的脚步，探寻单分子领域未来的技术突破方向

本文就David Walt科学家在单分子领域相关发表的重要期刊论文进行分析和描述。跟随David Walt的脚步，探寻单分子领域的研究方向。

本人认为截止目前，David Walt在单分子领域的研究可以分为3个阶段（个人观点，不喜勿喷）。

精确定量溶液中特定分析物浓度的方法都是基于许多分析物分子产生测量信号的系统综合响应的结果。早在2006年，David Walt在期刊NANO LETTERS^[1]上发表的一篇文章，介绍了一种飞升级别的微孔阵列，在该微孔阵列中过观察单酶分子催化的荧光产物在反应容器阵列上的聚集，应用泊松统计分析，获得了数字浓度的读数。这种方法被证明对单分子酶学和超灵敏的生物测定非常有价值。这项技术未来将允许使用不同类型的酶进行研究，并将利用酶联检测方法与高密度飞升阵列相结合，突破蛋白质和DNA靶标的超低检测极限。

在2008年J Am Chem Soc^[2]期刊上发布的名字表明研究团队发明了一种高灵敏度的单分子读出系统，利用飞升大小的反应容器阵列中的酶信号扩增来检测生物素化的DNA靶标。灵敏的DNA检测在临床诊断、基因治疗和各种其他生物医学应用中非常重要。检测和定量痕量的特定DNA序列在很大程度上依赖于靶扩增和各种信号扩增方法。

2009年作者在J Am Chem Soc^[3]期刊上发布的文章提出了一种利用电化学发光(ECL)作为读出机制同时检测多种抗原的新型微球芯片。该平台证明了使用ECL进行多指标同时检测的可能性，因为阵列中所有的微球同时被ECL成像和解析，通过实验结果证明了双重和三重检测以及避免交叉反应性到的方法。

在2010年，Simoa 技术在nature biotechnology^[4]期刊发表，同时是本期期刊的封面文章。该方法的技术路线如下，将约250,000个捕获抗体包被在2.7 μm的磁珠上，磁珠与样本反应后，加入生物素标记的检测抗体及亲和素偶联的酶和底物，通过微流控的方式将孵育后的磁珠与底物加在到飞升级别的微孔中，再进行油封。将单个磁珠封闭在4.5 μm的反应孔（Well）中进行反应（避免信号扩散和交叉反应）。每238,000个Well组成一张芯片（Array），每24个Array再组成一张光盘（Disc），Disc数据采集使用CCD摄像头捕获这些小孔中超过阈值的检测信号，标记为“on well”和“off well”。通过计算“on well”在Array中的比例，依据泊松分布理论，计算出目的蛋白的浓度，实现数字化定量，其精确度远超ELISA的模拟定量。由于磁珠经过多重荧光标记，通过计数不同颜色荧光磁珠的“on well”数量，即可同步获得多个检测指标的浓度定量值。

目前大多数检测miRNA的方法需要漫长的样品制备和扩增步骤，这可能会导至结果偏差。此外，缺乏特异性和可重复性给生物样品中循环miRNA的检测带来了各种挑战。2017年在Nucleic Acids Research^[5]期刊上发布的文章，借鉴Simoa微阵列的芯片，解决miRNA检测的问题。应用单分子阵列(Simoa)技术开发了一种超灵敏的三明治检测方法，可直接检测多个mirna，无需预扩增。研究团队成功地检测到了飞摩尔浓度的miRNA(检测限[lod]范围从1到30 fM)和高特异性(区分单核苷酸不匹配的miRNA)。

液滴可以高通量生成和分析，但液滴的稳定性需要表面活性剂来阻止液滴的聚结和交换其内容物。然而，表面活性剂也可能干扰一些生物学测定制备液滴的微流控装置的表面通常需要修改，以尽量减少与液滴的相互作用。因此，2018年发表在Anal Chem^[6]期刊上的文章证明描述了一种利用皮升微孔聚合物阵列分离和检测单个酶分子的新方法。在环烯烃聚合物(COP)中制备了一种包含微孔阵列的流体流池装置。COP微孔阵列通过消除其他微孔阵列格式中常见的大量器件制备和表面功能化，简化了实验。采用简单可靠的加载方法引入反应溶液，将单个酶分子捕获在皮升微孔中，随后用氟化油分离和密封。密封在COP装置中稳定数小时。皮升微孔装置可以通过数字读出计数活性孔的数量来测量低飞摩尔范围内的酶浓度。

Simoa免疫测定，像其他夹心elisa一样，高度依赖于生物素化检测抗体与链霉亲和素偶联酶的相互作用。2018年Bioconjug Chem^[7]期刊发表的文章主要通过使用5种不同的生物素化试剂和在生物素化过程中改变摩尔倍过剩生物素的量来比较这些Simoa检测的性能。发现，生物素化试剂的选择和摩尔倍过剩的生物素可以高度影响Simoa检测的性能，在灵敏度上的差异高达一个数量级。此外，使用不同的生物素化检测抗体测试了ELISA的性能，观察到灵敏度的差异超过一个数量级。结果表明，评估检测抗体生物素化的不同策略是一种优化免疫测定性能以提高灵敏度的简单方法。

小分子检测对于临床诊断、药物发现、环境样品和农产品测量等许多应用都很重要。当前的小分子检测技术存在分析灵敏度低、样品处理复杂等诸多局限性。研究团队开发了一种超灵敏的竞争免疫检测方法，使用单分子阵列(Simoa)进行小分子检测。该部分研究内容再2018年发表在J Am Chem Soc^[8]期刊。研究表明，竞争性Simoa检测比传统ELISA的敏感性高约50倍。通过理论计算，以确定影响竞争性Simoa测定灵敏度的因素，并使用它们来实现最大灵敏度。文章中检测额复杂生物样品中的小分子，证明竞争性Simoa试验是一种简单、快速、高灵敏度的小分子超灵敏检测方法。

滞后是酶催化反应的一个重要特征，因为它反映了配体(如底物或变构分子)存在时酶调节的影响。在典型的酶活性动力学研究中，滞回行为表现为催化反应时间过程中的“滞后”或“爆发”。这些滞后和爆发是由于酶分子从一种状态到另一种状态的过渡相对缓慢，不同的状态具有不同的动力学性质。然而，由于群体中不同酶分子的行为是随机的，因此很难通过观察体反应来理解滞后的潜在机制。2019年研究团队在ACS Cent Sci^[9]上发表重要工作，在这项工作中，利用高通量单分子阵列平台研究了突变的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的滞后行为，并研究了热处理对其滞后行为的影响。

2020 年，在J Am Chem Soc^[10]期刊上继续发表了与酶相关的文章。酶分析对于包括临床诊断、功能蛋白质组学和药物发现在内的许多应用都很重要。目前的酶活性测定方法常存在分析灵敏度低的问题。以肽修饰的MBs为底物的eSimoa法检测蛋白激酶示意图。研究团队开发了一种利用单分子阵列(eSimoa)检测酶活性的超灵敏方法。eSimoa测定是通过将底物偶联到顺磁珠上并使用单分子分析测量底物到产物的转化来完成的。

虽然单分子阵列(Simoa)或数字ELISA等数字测量方法在灵敏度方面取得了重大进展，但仍有许多潜在的疾病生物标志物存在于可获得的生物流体中，其水平低于这些技术的检测极限。为了克服这一障碍，2020 年，在J Am Chem Soc^[11]期刊上文章讲述了研究团队开发的一种简单的单分子计数策略，dropcast单分子测定(dSimoa)。通过提高采样效率和更简单的工作流程，可以计数更多的目标分子。在这种方法中，珠子简单地滴投到显微镜载玻片上，干燥成单层膜，用于数字信号读出。将免疫检测与RCA（滚环扩增）技术相结合。在抗体包被的顺磁性微珠上形成单个免疫复合物三明治并用链霉亲和素-DNA 偶联物标记后，对微珠进行滚环扩增 （RCA） 以产生连接到每个免疫复合物的长连接子。在 RCA 期间，荧光标记的 DNA 探针与连接子杂交，以在携带完整免疫复合物三明治的珠子上产生局部荧光信号。RCA后，将珠子浓缩，滴投到显微镜载玻片上，并使其干燥以形成单层薄膜。通过液滴膜的荧光成像和计数“开”和“关”磁珠来计数单个靶分子。

许多蛋白质在生物样品中以低浓度存在，因此，超灵敏的蛋白质检测技术是必要的。为了克服灵敏度方面的挑战，研究团队开发了比传统ELISA灵敏度高1000倍的数字酶联免疫吸附试验(ELISA)，并允许subfemtomolar蛋白检测。然而，这种灵敏度仍然不足以测量各种生物样品中的许多蛋白质，从而限制了检测和发现生物标志物的能力。

为了克服这一局限性，研究团队开发了一种使用数字ELISA（dELISA）和微流控技术检测低蛋白水平的简单方法^[12]。微滴数字ELISA通过提高采样效率和计数更多的靶分子，达到最大的灵敏度。微滴数字ELISA可以在低滴度范围内检测蛋白质，比目前超敏感蛋白质检测的金标准工具单分子阵列(Simoa)数字ELISA的灵敏度高25倍。使用微滴数字ELISA检测了LINE1/ORF1蛋白，这是一种潜在的癌症生物标志物，之前从未在血清中检测过。此外，由于设备设计简单，液滴数字ELISA在床旁应用中很有前景。因此，微滴数字ELISA将有助于发现以前从未被测量的生物标志物，用于各种临床应用。

虽然dELISA和Simoa等技术正在研究和临床实验室中应用，以开发超灵敏的临床诊断检测方法，但运行这些数字检测所需的仪器的规模和成本妨碍了它们被应用到床旁诊断格式。

在202年的ACS Sens^[13]期刊上发表的另一篇文章中报告了一种更适合床旁技术的简化数字ELISA格式的开发，称为催化报告沉积数字ELISA (catalyst reporter deposition digital ELISA, CARD-dELISA)。利用CARD酪胺信号放大技术产生的珠上信号与纤维蛋白水凝胶中的珠固定相结合，以简化的工作流程格式进行单分子计数。CARD-dELISA可用于超灵敏的蛋白检测(IL-6: ~ 1fm)，其动态范围与传统Simoa检测相似。

单分子阵列(Simoa)是一种基于微球的数字酶联免疫吸附法，是目前超灵敏蛋白质检测的最新技术，可以检测亚飞摩尔蛋白质浓度，但其实现高阶多路复用而不发生交叉反应的能力仍然是一个挑战。2020年，研究团队在Adv Healthc Mater^[14]期刊上发表文章，讲述了多重Simoa测定通过顺序捕获每个蛋白质分析物，然后将每个捕获头仅与相应的检测抗体孵育，以消除结合试剂之间的交叉反应性。该策略不仅减少了对背景水平的交叉反应性，显著提高了测量精度，而且还实现了多重检测样本复用。

目前的数字ELISA技术对许多罕见的蛋白质生物标志物的灵敏度仍然不足，并且需要专门的仪器或耗时的工作流程，这限制了它们的广泛实施。2022年在ACS Nano^[15]上发表的文章，讲述了一种新的单分子免疫检测方法MOSAIC，一种更灵敏、更精简的数字ELISA平台，即分子珠上信号扩增个体计数(Molecular On-bead Signal Amplification for Individual Counting, MOSAIC)，该平台的检测原子摩尔下限较低，灵敏度比其他方法提高了一个数量级。MOSAIC为稀有目标分子提供了高采样效率，分析珠数可以很容易地调整，以提高高测量精度的信号到背景。此外，与基于微孔或液滴的数字方法相比，基于溶液的MOSAIC信号读出扩展了可同时测量的分析物数量，以飞摩尔或更低的灵敏度进行多重检测。

将纳米孔作为高灵敏度、定量诊断工具的进展受到了一些挑战。一个主要限制是纳米孔检测疾病生物标志物的灵敏度不足，这些生物标志物通常以pM或较低浓度存在于生物液体中，而第二个限制是不同分析物一般缺乏独特的纳米孔信号。2023年在ACS Nano发表的文章中介绍了一种新的纳米孔应用策略，该策略利用免疫捕获、等温滚圈扩增和产品的序列特异性片段来释放多个DNA报告分子用于纳米孔检测。这些DNA片段报告器产生一组纳米孔信号，形成独特的指纹或簇。因此，这种指纹签名允许生物标记物的鉴定和定量分析。

写在文末，本人来总结下大佬在单分子技术上的研究历程，通过多项研究逐一突破Simoa各个技术环节的壁垒，最后形成一款核心的技术产品，经过对产品不断的优化和更新，使产品性能逐渐稳定。但大佬并未就此停下脚步，在不断的尝试新的技术原理，不断更新检测的灵敏度如dELISA，不断优化产品应用场景如dropcast技术和MOSAIC技术。

基于目前市场上蛋白质研究新技术的不断更新迭代，蛋白检测与PCR技术相结合也在不断的突破。