承接上文三代测序学习笔记-技术起源1，我们继续 从分类上纳米孔可以分为固态和生物两类，两者都有检测纳米级目标分析物的能力，都可用于检测单分子水平的生物分子和化学分子。 一，常见生物纳米孔蛋白有： 1，α⁃溶血素(α⁃hemolysin，α⁃HL)纳米孔
第一, α-HL易于自组装且结构稳定,具有均一的电导,从而使得待测物产生的阻断事件具有可重复性; 2， MspA纳米孔
上图A为α⁃溶血素，B为MspA；MspA是耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis细胞外膜中的主要成分。MspA纳米孔是由相对分子质量2.0×104的MspA单体蛋白构建的同源性八聚体,形似烟囱,最窄处直径为~1.2 nm,长度为~0.5 nm,极短的 β-桶和极小的孔径使不同核苷酸穿过该通道时能产生更易分辨的特征阻断电流。MspA纳米孔具有超强的热稳定性和化学稳定性,能够在50 ℃、2%十二烷基磺酸钠溶液中保持良好的通道活性。同时MspA易于进行多位点突变修饰,是一种良好的纳米孔检测传感器。 MspA 与 α-HL 具有相似的机理，能更好地结合金属离子以稳定蛋白质结构。此外，ssDNA 通过 MspA 纳米孔产生的离子电流差异更大，信号更清晰。MspA 是一种八聚体，最小内径为 1 nm，比 α-HL 的通道窄，但更稳定，因此可以提高 DNA 测序的信号分辨率，在极端条件下的结构稳定性也优于 α-HL。 MspA 极具前景的特性和完美的几何形状使其成为一种坚固的纳米传感器，并促使人们制备 MspA 突变体以进一步改善性能。迄今已有三种著名的 MspA 突变体，如下图：
(A) M1MspA 和 M2MspA，99 (B) M3MspA 和 (C) MspA-MspB17 可以发现，大量的工作在于改变孔内蛋白的氨基酸组成，以改变转运动力学、孔-分析物相互作用，最终目标都是一致的，比如结构更稳定（芯片效期更长）、更灵敏（不同碱基的离子电流差异更大），信号更清晰等等，最终提高测序质量、测序效率、降低测序成本等等。大量的专利攻防战也是体现在孔道蛋白的发现、定点突变位点的设计上面（后文会讲到）。 MspA在蛋白质/多肽测序领域也极具前景，南京大学化学化工学院、生命分析化学国家重点实验室、南京大学化学和生物医药创新研究院（ChemBIC）黄硕课题组原创开发了一种名为“纳米孔错位测序技术（Nanopore-Induced Phase-Shift Sequencing, NIPSS）”的测序技术，NIPSS已经成功实现了除DNA外其他生物大分子的测序，如非天然核酸（XNA）和microRNA的直接测序。在此工作中，我院黄硕课题组使用NIPSS技术成功展示了多肽的纳米孔测序技术原型（如下图）。
毫无疑问，纳米孔测序的核心就是镶嵌在合成膜中的蛋白纳米孔。有文献称，Oxford nanopore在弃用α⁃溶血素之后，在后期的纳米孔芯片中使用了MspA作为孔道蛋白，而在最新的R9和R10系列孔都使用了一种新的孔道蛋白：CsgG蛋白 3， CsgG 纳米孔 2014年，比利时布鲁塞尔自由大学的结构生物学家Han Remaut教授的研究小组，在Nature Letters上发表了大肠杆菌的一种膜蛋白CsgG的X射线结构文章。
“通过观察这个通道，我们发现这个通道具有的特点可能会适用于纳米孔传感应用。”Han Remaut教授进一步解释说，特别是通道在其中心具有明确定义的收缩，当分子通过孔时，该收缩会调节电流信号。该文章发表后，Oxford Nanopore获得了该团队专利的使用授权，将CsgG及其衍生物用于传感应用，并开始了双方的合作。2016年早些时间，Oxford Nanopore宣布将采用R9新型纳米孔化学试剂，并称其为大肠杆菌CsgG的工程版本。 如下图，左边为Han Remaut教授的文章截图，右侧为Oxford Nanopore公司的产品ppt介绍。可以发现中间拥有一个非常狭窄的蛋白孔道，极大地提高了检测精密度。 这些纳米孔蛋白，Oxford Nanopore公司称之为Reader蛋白，通过持续不断的研发工作，至今共发布了8款不同版本的纳米孔及适配的马达蛋白（后文会讲述）：R6(2014年6月)，R7(2014年7月)，R7.3(2014年10月)，R9(2016年5月)，R9.4(2016年10月)，R9.5(2017年5月)，R10(2019年3月)和R10.3(2020年1月)。随着R9.4版本的纳米孔与其适配的马达蛋白的出现，ONT测序达到了更高的准确度（85~94%）以及更快的测序速度（450bp/s）。
4， 噬菌体phi29连接器 噬菌体phi29连接器主要由12个gp10亚基组成一个~7.0 nm的通道,其窄处的直径3.6 nm,宽端开口直径6.0 nm。在高盐和强酸强碱(pH=2.0~12)的环境中,噬菌体phi29连接器通道仍能保持稳定的通道特性。 目前,关于噬菌体phi29连接器研究最多的是与6个包装的RNA(pRNA)和ATP酶蛋白gp16组装成噬菌体phi29包装马达,作为复合体进行纳米孔研究。由于通道直径较大,能够实现较大生物分子如双链DNA(dsDNA)和高分子聚合物的检测。 5，Aerolysin纳米孔 Aerolysin是从嗜水气单胞菌中提取的 β成孔蛋白,是一种与人体腹泻病症以及深度伤口相关的革兰氏阴性杆菌属,成熟的Aerolysin可与真核细胞膜表面的糖蛋白受体相结合,并插入细胞膜形成一个孔道,改变细胞膜的通透性并最终导至细胞死亡。在水溶液中Aerolysin单体会自发地形成一个具有蘑菇状外形的七聚体结构,宽度为~15 nm,高度为~7.0 nm,形成的孔道直径为1.0~1.7 nm,其形状与目前在纳米孔技术中广泛应用的 α-HL类似,但在 cis端没有前庭结构。Aerolysin最早于2006年首次应用于纳米孔生物传感器,进行 α-螺旋胶原蛋白结构的研究,随后被用于分析蛋白的折叠和去折叠动力学过程、多肽、蛋白结构、低聚糖的聚集程度和酶降解的动力学等。是一种非常有价值的用于蛋白测序的纳米孔蛋白。
上图来自南京大学龙亿涛教授团队与北京大学陈鹏教授团队的共同合作与探索，相关成果以“Controlled Genetic Encoding of Unnatural Amino Acid in Protein Nanopore.”为题，发表于德国应用化学（Angewandte Chemie International Edition）。主要成果是使用非天然氨基酸重构了纳米孔道，使单个多肽分子在孔道内的阻断时间延长了十倍，实现了对混合样品中不同长度多肽分子的精准区分。 孔道蛋白氨基酸定点突变这一过程和核酸测序纳米孔蛋白的生物工程改造非常相似，后文会讲到为什么延长"阻断时间"在核酸测序还是蛋白测序是那么的重要。 6，曲霉毒素C（FraC）纳米孔 不再赘述，也是一种微生物分泌的打孔毒素，目前主要研究关注在于蛋白质/多肽测序。
上图来自于：Florian Leonardus Rudolfus Lucas 1,3, Roderick Corstiaan Abraham Versloot1,3, Liubov Yakovlieva2, 1-6 结构对比：
上图来自Recent advances in biological nanopores for nanopore sequencing, sensing and comparison of functional variations in MspA mutants。 二，从纳米孔测序专利上看纳米孔蛋白的专利布局： 1，Oxford Nanopore i，美国专利： 使用"Oxford Nanopore Technologies Limited"+"pore"在专利查询网站上搜索美国专利，一共23项，其中基本都是对发现的纳米孔蛋白及突变位点进行技术封锁。
以US20190071721A1 MUTANT PORE 这项专利为例（针对的是最新的孔蛋白CsgG），如下图，可以发现真的是严防死守了，：
ii，中国专利： 在中国的市场，也是必须做防范措施的
以第一项为例如下图，同样也是严防死守：
可以想象，我们中国人要想冲出无人区，是有多么的困难。这倒不是说Oxford Nanopore是卑鄙的，从2005年成立到现在，Oxford Nanopore一路披荆斩棘，我们绝对的respect。这个过程中，大量的孔蛋白的结构鉴定、筛选、突变、验证，这个过程中人类智力、经费、精力的耗损，百倍、千倍甚至万倍于“爱迪生发明碳丝灯泡做了大约1600次实验，最终选择了日本竹”这个典故。随便翻翻这些综述就敬佩不已，有机会一定要把几篇综述好好拜读。
这个过程中，有一类科学家居功甚伟，就是结构生物学家，这些优质的纳米孔蛋白的鉴定，是和这些科学家的坚持分不开的。普通大众随便被忽悠就会鄙视“颜宁当选中科院院士”，认为买个电镜就能带来大量文章，是非常naive、非常不尊重基础科学的体现。 2，其他： 按”纳米孔“+”测序“搜集专利网：
Genia在同年被罗氏以3.5亿美元的总价收购。在被罗氏收购之前，Genia声称已经开发了纳米孔测序仪的alpha版本，预期在2013年底进行客户的beta测试，并将在2014年商业化推出。在2016年的时候，罗氏/Genia联合合作的哥伦比亚大学Jingyue Ju教授及哈佛大学的Geroge Church教授课题组背靠背在PNAS上发表了其纳米孔测序的原理验证，他们设计了一个 264 纳米孔阵列，实现了对 83 个碱基的 DNA 模板链以及 12 个碱基的均聚物区域的测序。 但十年过去了，我们依然没有看到罗氏的纳米孔测序仪。（从一些信息渠道了解到，Genia生化的部分已经比较完善，似乎这与测序仪另外的技术部分：半导体和芯片的专家田晖博士及一众芯片相关高管离开罗氏有关） 田晖博士2016年离开创立了Axbio安序源。2023年05月28日，第二十届中国国际检验医学暨输血仪器试剂博览会（CACLP）在南昌绿地国际博览中心开幕。当日上午，“智慧降本·精准测序：长读长测序技术应用进展研讨会暨安序源新品发布会”成功举办，第四代测序企业安序源正式发布其第四代纳米孔基因测序平台：AXP100-RS基因测序仪。 但是安序源中文官网上仍旧没有看到该设备，而诡异的是，在英文官网上，AXP100在2019年6月28号就在深圳某次活动上发布过了。并且，在中国专利网上并不能搜索到安序源的任何专利。在美国专利网上，也仅能搜到少得可怜的11项专利。
ii，江苏先声医学诊断有限公司 一共21项，均为生信、建库方法学的专利，这正是先声在享受技术、开发应用方面的强项，并无志于三代测序的仪器和专利纳米孔开发。
iii，东南大学 东大在医疗器械设计领域享誉天下，毫无悬念，专利15项，强项在于硬件设计。
iv, 北京大学 都是硬件专利，且技术一般。本来乍一看到CN102590314B 核酸分子在固态纳米孔中的减速方法这一项还有点兴趣，仔细一看，还不如乍一看，通过反向施加压强外场作用的这个技术，好像人尽皆知啊。
v, 齐碳科技 作为中国第一家有正儿八经产品出货装机的真正国产的第三代测序公司（请看：齐碳科技完成近亿元C+轮融资，IF86！国产纳米孔测序平台研究成果首登顶刊柳叶刀！多重耐药研究又有新发现！），一共有37项专利（齐碳科技实际上三代测序总专利数为83）。 有硬件专利：
有生信专利：
有本文讲述的重点：纳米孔蛋白的专利：
真是令人欣喜：齐碳, 是真真正正在做产品的。 END. |
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