三代测序技术丨技术起源

前言：

这是必将代替目前已发展至顶峰的二代测序（NGS）的技术，新老技术的迭代在后疫情时代只会越来越快，我相信不远的未来，科幻电影中的场景都会实现。

有部首映于1997年的《GATTACA》不知道给多少人留下了印象。这部电影在我国被翻译成《千钧一发》。影片讲述了主人公Vincent从一出生就有基因缺陷，而他的弟弟Anton则是通过基因挑选技术诞生的“正常人”。Vincent非常想参加由遗传精英组成的戛塔卡公司，因为那样才能参加前往“迪坦"星的太空旅行。他用因事故导至瘫痪的“正常人”Jerome的血样和尿样报名参选飞行员，不仅如愿以偿，还赢得搭档的爱情。虽然一起凶杀案差点让Vincent 前功尽弃，但最后事实澄清，Vincent 飞上了浩翰的太空。

现在回想起来，我印象最深的是镜头反而是，Vincent在指模中注射了Jerome的血样，然后在安检处手指穿刺采样，机器马上就出结果，Vincent得以蒙混过关。

这个检测速度实在太快了！科幻的意义我想就在于此，2023-1997=26年，目前虽然不管二代测序还是三代测序的临床实验比如宏基因组，都还做不到这么快。但是如果只是为了核实一个人的信息比如法医鉴定STR，我认为三代测序技术已经具有这么快的功力基础，只是需要在应用层面需要打磨了。

一代测序和二代测序：

搞定客户有1000杯奶茶理论，搞懂一个技术我想应该适用1个G资料理论。贴两个经典的理论图吧，具体原理不赘述了：

1，一代测序（Sanger测序, 双脱氧末端终止测序法）

2，二代测序（可逆末端中止法，DNA簇技术或DNA纳米球技术）

可以看到，都是玩光的把戏，一代测序还好理解，而二代测序的仪器原理、运作逻辑、建库细节更是复杂精密到极点：

光路系统：

测序流程（下图为代表性的IDT 靶向捕获建库方法）：

实在是太麻烦了，所以医疗科研单位自建NGS实验室，熟练高质量的操作人才的培训和质控是非常难的。对于医疗科研单位而言，还有一个麻烦就是场地。房间和流程的匹配复杂度、建设难度也是新冠PCR实验室的好多倍。

大道至简，一句戏言大家都能脱口而出：高端的食材往往只需要最简单的烹饪方式，科学往往也是如此：最复杂的功能需求往往只需要最简单的结构设计，而三代测序就是脱胎于生命的奇妙设计。

三代测序

技术起源1：

纳米孔分析技术是从20世纪90年代中期开始发展起来的新型单分子分析手段。1996年,Deamer、Branton和Kasianowicz等首次报道了利用金黄色葡萄球菌 α-溶血素( α-Hemolysin, α-HL)天然生物通道蛋白获得单个单链DNA(ssDNA)分子和RNA分子的阻断电流信号。这项具有划时代意义的研究为纳米孔分析技术奠定了基础。

而α-溶血素是啥玩意？他是由金黄色葡萄球菌分泌的孔道蛋白，能插入到红细胞膜结构中；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,金葡菌)是人和动物细菌感染中最常见的病原菌,能引起从表层皮肤疖痈到威胁生命的败血症、脓毒血症等多种疾病。金葡菌分泌的α-溶血素(α-hemolysin,Hla)是金葡菌中最重要的毒力因子。目前很多研究中发现Hla是作为打孔毒素(Pore Forming Toxins,PFT)发挥作用的。

Α-溶血素的前体由319个氨基酸组成，其前体通过聚集形成了一个相对分子质量为2.32×10⁵的七聚体，然后再通过折叠形成一个β桶状的跨模区域，此区域为1.4×10^－9米，它可以允许分子量小于2ｋDA的分子通过，如钾离子、钠离子，从而引起靶细胞的坏死。可以把细胞想象成一个气球，金黄色葡萄球菌分泌了很多能打孔的针管。

生命就是如此奇妙。三代测序的起源居然是金黄色葡萄球菌分泌的打孔毒素。