微生物基因组产品的十问十答：你想知道的答案在这里！

GC-depth 图是表征整个基因组 GC 含量和深度分布的关系，具体方法是对基因组序列进行一定长度切分，每个窗口都有特定的 GC 含量和 Reads 覆盖深度，对应图中的一个点。对于较纯的样本，会集中在某个区域，向四周弥散。而如果 GC-depth 图分开成了多个集中区域，一般意味着该组装结果中包含来自不同来源的 DNA，特别是 GC 层面上如果分开的话，有外源污染可能性很大。GC 不分离，仅深度分离时，也有可能是部分来自质粒的 DNA，需要结合其他信息，如 NT比对结果来具体分析。 

图1 GC 含量与测序深度（Depth）关联分析统计图

组装软件会将测序数据看作来自同一个基因组的前提下进行组装，如果有外源DNA混杂，不同来源的DNA中的序列会对组装产生干扰，为保证组装的准确性，只能将可疑的部分切断成不同的碎片序列，从而导至最终的组装只能拿到碎片化的序列。

我们分析样本基因组的测序深度发现：染色体的reads测序深度在100x左右，成环质粒的测序深度在80x左右，而不成环质粒的仅在20-40x左右。所以，很可能是因为这些样本的质粒拷贝数少，导至质粒的测序深度没有达到足够的乘数，因此质粒组装没有成环。

图2 质粒圈图

真菌基因预测有三种方法：从头预测、同源预测及基于转录组数据预测。从头预测使用Augustus软件，同源预测使用Genewise软件。基于同源比对需要提供同种的编码基因序列，而且越近缘对预测结果越好。客户最好能提供近缘物种的编码基因信息，或者组装好的转录本序列文件。三种方法预测的结果将通过EVM进行整合，所以如果客户能提供近缘参考序列和转录数据，结合三种方法的预测结果最好。

组装序列中是否存在此基因？如果不存在，可能是这个基因没有被组装出来，那么肯定也不会被注释到。如果有这个基因，但是没有被注释，有可能数据库中没有这个基因或者是没有被本地数据库收录。

Q：关于ncRNA注释，为什么注释不到 5S/16S/23S 的序列？

在使用denovo方法预测ncRNA序列时，需要完整的ncRNA序列，才能确认ncRNA的结构，而由于ncRNA，特别是16S和23S序列，往往本身就有一定的重复序列成分，在组装过程中很容易组装不完整，如果整条rRNA没有拼接成一条完整序列，是无法预测得到相应的rRNA序列的。如组装较好，该样本对应的物种在数据库注释的少，还是会注释不到。在一些真核新物种的样本中，会经常出现18S等数目为0的情况，这个是因为之前这个物种并没有进行过18S序列测序，所以数据库以及常用软件中没有收录该物种的18S序列，所以没有办法在组装结果中预测出18S。

Identity表示相似性，即序列的一致性。这个值越高，表示同源性越高，序列相似度越高，越有可能是行使相同功能的基因。Score 是比对得分，是打分矩阵计算出来的值，是搜索算法决定的，这个值越大说明你的序列跟目标序列匹配程度越大；Evalue值就是Score值可靠性的评价。它表明在随机的情况下，其它序列与目标序列相似度大于Score值的可能性，所以它的分值越低越好。

韦恩图中每个椭圆表示一个样本，每个区域上的数据表示在且仅在此区域的样本中出现的group的个数，如下图，一个group表示一组具有大于50%相似性、序列长度差异低于0.7的基因集。表格中统计的是基因的个数，图说明的是基因集的个数。

图3 Venn 图

利用MUMmer比对软件，将每个样本与参考序列进行全局比对，找出样本序列与参考序列之间有差异的位点并进行初步过滤，检测出潜在SNP位点；提取参考序列SNP位点两边各100bp的序列，然后使用BLAST软件将提取的序列和组装结果进行比对，验证SNP位点。如果比对的长度小于101bp，则认为是不可信的SNP，将去除；如比对上多次，认为是重复区域的SNP，也将被去除；最后用BLAST、TRF、Repeatmask软件预测参考序列的重复序列区，过滤位于重复区的SNP。最后得到可靠的SNP。

系统进化树的构建有三种方法：

1，基于SNP建树：用样本和参考菌株群体的SNP矩阵构建系统进化树。按照相同顺序将所有SNP相连，获得相同长度的序列，用PhyML软件构建系统进化树。

2，基于core-pan分析建树：用core-pan分析鉴定出样本的单拷贝core基因，利用MUSCLE软件进行蛋白多序列比对，用TreeBeST软件构建系统进化树。

3，基于基因家族建树：用基因家族聚类鉴定出的单拷贝直系同源基因结果，利用MUSCLE软件进行蛋白多序列比对，用TreeBeST软件构建系统进化树。

图4 系统进化树图