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液态活检面面观(下)

2019-6-6| 编辑: 小桔灯网| 查看: 548| 评论: 0|来源: 靶向分子诊断丨作者:温焕焕

摘要: 液体活检即循环肿瘤组学,是精确肿瘤学的创新领域,可以克服当前组织活检的局限性。 肿瘤循环组学中,循环肿瘤DNA(ctDNA)和循环肿瘤细胞(CTC)是美国FDA唯一批准用于指导临床应用的。 细胞外囊泡(EV),循环肿瘤 ...


液体活检即循环肿瘤组学,是精确肿瘤学的创新领域,可以克服当前组织活检的局限性。 肿瘤循环组学中,循环肿瘤DNA(ctDNA)和循环肿瘤细胞(CTC)是美国FDA唯一批准用于指导临床应用的。 细胞外囊泡(EV),循环肿瘤RNA(ctRNA)和肿瘤教育/修饰的血小板(TEP)是相对较新的肿瘤组成成分,但在癌症治疗的每个阶段都具有很大潜力。 本文主要讨论肿瘤循环组学各成分的临床应用以及目前限制其在临床应用实施的主要因素。

(续)


细胞外囊泡EV

EV是在生理和病理条件下从所有细胞类型中释放的膜状颗粒,是在不同刺激下产生的,如蛋白酶、ADP、凝血酶、炎性细胞因子、生长因子、生物力学剪切和应激诱导物以及凋亡信号等刺激。 EV几乎存在于所有体液中,尤其是血液中。 一度认为EV是细胞消除非必需成分的简单途径。过去十年的发展中,EV被认为是细胞间通讯的基本介质,调节和参与多种生理和病理过程,包括癌症的调节。 基于EV不同的的生物发生、内容物和分泌途径,可将EV分为两大类:外泌体和微泡。

细胞外囊泡作为癌症生物标志物的临床意义

EV携带的分子成分被认为是细胞起源的分子指纹,基于此EV适用于肿瘤生物标记物。与ctDNA和CTC相比,EV在临床癌症诊断中的应用受限,限于EV的分离、分析灵敏度以及稳定性,EV具有较多潜在优势。与CTC相比,EV通常大量生产和释放,在外部脂质膜保护下维持着囊泡成分的稳定性。

与ctDNA和CTC类似,EV可用于定量和定性分析。EV的定量信息可预测恶性疾病和肿瘤负荷的存在。例如,乳腺癌和胰腺癌患者的循环外泌体水平显著增高,多发性骨髓瘤(MM)患者的循环微粒(MP)的数量比健康个体多。此外,循环MP有望应用于晚期NSCLC的诊断和预后。

EV中包含的核酸和蛋白质成分等可提供定性信息。 EV中的编码和非编码(nc)RNA等RNA成分已被广泛研究。 外泌体DNA最近作为生物标志物而受到关注,例如在胰腺癌患者的血清外泌体中检测到KRAS和TP53的突变。 另一项研究中证实,胰腺导管腺癌(PDAC)患者的外泌体KRAS突变比CA 19-9具有更好的预后分层。

EV囊内和膜上都携带有蛋白质,并且已有多篇报道证明EV蛋白可作为癌症生物标志物。 Melo等人证明了循环外泌体磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC1)可区分PDAC与健康人群,准确度高达100%。 最近,Moon等人证明了EV Del-1和纤维连接蛋白可作为早期乳腺癌诊断的生物标志物。 此外,已证实MM中循环CD138 + MP水平增加,并且CD138 + MP在预测患者复发风险和治疗反应方面具有显著预后作用。 最后,annexinV + EpCAM +去唾液酸糖蛋白受体-1(ASGPR1)+循环MP可用于肝细胞癌和胆管癌的诊断,CD147 + EpCAM + MP是CRC的预测因子。

EV分离和分析技术以及最新进展

限制EV作为液体活检应用于临床的最大问题是缺乏样品处理和EV分离分析的标准化流程,这影响临床应用的可重复性。目前EV的分离程序包括许多生物样本处理步骤,并且EV易受到不同类型的物理和化学损伤,可能损害EV和/或改变它们的生物和物理性质。 影响EV研究可重复性的另一个因素是缺乏EV命名和定义的标准化指南,以及验证所需的对照实验。 为了克服这些局限性,国际细胞外囊泡学会最近更新了全面的指南和建议集。

与CTC类似, EV的传统分离方法是利用物理(密度和大小)和生物(表面标记的表达)特性。 EV分离最常用的方法是基于密度的方法,例如差速离心和/或超速离心和密度梯度离心。其中,差异超速离心技术被认为是金标准技术,尤其是用于外泌体纯化。 虽然这些技术使用广泛,但设备昂贵、耗时,且不能保证产物纯度,通常使用中会找到纯度和回收率的折衷点。

过滤和尺寸排阻色谱(SEC)是基于尺寸技术。 过滤可得到高产率和高纯度产物,但受限于EV对过滤器的粘附和高压引起的囊泡损伤。 与超速离心相比,SEC可以更好地回收EV。

免疫亲和捕获方法使用了与EV表面标志物的抗体缀合的磁珠。 该方法的优点是可产生高纯度的EV成分,可基于表面标记物分离出特定的EV子集。 相比之下,这个特征也受限制,可能所选标记物缺少表达而遗漏了潜在重要的EV亚群。免疫亲和捕获与微芯片的整合技术,可进行原位免疫分析[57]。

另一种常用的外泌体分离方法是聚合物沉淀法。 该方法使用聚合物[例如聚乙二醇(PEG)]来降低EV的溶解度,再通过快速低速离心进行沉淀。 该方法产率高,但纯度低。

最近出现了EV电场分离法。Lewis等人开发了一种交流电动(ACE)芯片,能够在30分钟内从全血中捕获外泌体并进行原位免疫荧光分析。作者通过评估GPC-1和CD63的适用性来验证该芯片可用于PDAC的诊断标志物。

最后,有一种基于微流体的新型EV分离方法。该基于不同的EV特性,例如基于纳米尺度的过滤法、具有抗体功能的微流体通道和螺旋惯性微流体装置。Ko等人最新开发了一种磁性纳米孔分选平台,该平台已被用于分离特定癌症来源的EV。他们使用该系统鉴定PDAC小鼠模型的miRNA特征,设计机器学习算法用于不同癌症状态的分类。微流体技术旨在促进实验室芯片系统的开发,以实现快速、经济、集成的EV隔离和分析,用于EV的即时诊断。

EV检测方法也正在发展进步,尤其在蛋白质成分分析方面。常用的分析技术包括WB、ELISA、质谱(MS)和流式细胞仪(FCM)。除FCM外,这些技术主要用于EV批量分析,而不评估个体差异。 FCM目前用于单MP表征分析,但受限于小尺寸而无法分析单个外泌体。 目前外泌体FCM分析涉及多个外泌体与较大珠子的结合。最近,Kibria等人开发了一种microFCM平台,能够评估乳腺癌患者单循环外泌体中CD47的表达。另一种技术比当前流式细胞仪具有更高的尺寸分辨率,可进行单EV蛋白质表型分析,该技术是纳米粒子追踪分析(NTA)的变体,其中荧光抗体可用于鉴定表达特定标志物EV。尽管NTA具有更好的尺寸分辨率,但FCM的最大优势是其具有更高的通量。

循环肿瘤RNA

ctRNA是指来源于癌细胞的循环游离RNA。 1978年首次记录了细胞外RNA的存在,并且几年后发表了其作为癌症生物标志物的第一份报告。 与DNA相比,RNA是一种相对不稳定的分子,其在血浆中的半衰期为~15 s。ctRNA与蛋白质、蛋白脂质复合物和细胞外囊泡的结合可增强其稳定性。


ctRNA作为肿瘤生物标志物的临床意义及其局限性

几乎所有已知类型的RNA都在体循环中被发现,一定程度上,每种RNA都有可能作为癌症的生物标志物。与肿瘤循环组学的其他组成部分类似,ctRNA可用于定量和定性。事实上,尽管编码和ncRNA含有最重要的信息,但肿瘤特异性融合转录本或替代性剪接事件仍需鉴定。最适合作为生物标志物的ctRNA是mRNA、miRNA和长ncRNA(lncRNA)。他们的分析技术包括qRT-PCR或基于dPCR的单个RNA的评估,或通过RNA-Seq对一小组RNA(特别是miRNA)特征的综合分析。

循环外泌体mRNA已应用于验证CRC患者的KRAS和BRAF基因突变状态,并且外泌体EGFRvIII mRNA可用于诊断EGFRvIII阳性高级别胶质瘤。一项报告中显示,ddPCR检测到的血浆外泌体中雄激素受体剪接变体7(AR-V7)是前列腺癌中激素治疗抗性的良好预测因子。 囊泡和非囊泡mRNA中含有许多肺癌相关的基因融合,也可作为生物标志物。非囊泡ctRNA中,循环人端粒酶逆转录酶(hTERT,端粒酶复合物的催化亚基)mRNA在前列腺癌中比PSA具有更高的诊断和预后准确性。

关于miRNA,血浆外泌体miR-196a和miR-1246可用于早期诊断胰腺癌,并且miRNA组已被证明是肺癌诊断或预后的可靠生物标志物。 最近,血清外泌体miRNA被证明是神经胶质瘤鉴别诊断的新工具。

lncRNA是RNA潜在生物标记物。 例如,血浆外泌体LINC00152与胃癌有关,血清外泌体中两种mRNA和一种lncRNA的组合对CRC具有诊断潜力。 此外,血清外泌体HOTAIR lncRNA可用于多形性胶质母细胞瘤的诊断和预后。最近研究证实,五个循环lncRNA有望作为胃癌的诊断生物标志物。

迄今为止,临床环境中应用ctRNA最大限制因素是分析前和分析中操作步骤。尽管循环RNA与不同分子结合从而受到保护,但在4°C储存条件下仍不稳定,并受限于提取速度。此外,不同的提取方案具有不同的回收率,目前尚未就最佳提取方案达成共识。同样,实验室芯片似乎可以解决此问题,对样品进行快速、集成的纯化和分析,同时最大限度地减少操作。Potrich等人开发的微装置对此进行验证,其能够从细胞培养基上清液中选择性地提取miRNA并进行原位逆转录和qPCR分析。另一个例子是集成式综合液滴数字检测(IC 3D)系统,该微流体平台能够在3小时内直接定量血浆中极低浓度的miRNA。


肿瘤教育/修饰的血小板TEP

TEP是肿瘤组学中用于生物标志物分析的最新成分。癌症“血小板教育”是指癌症患者血小板中存在特定的RNA特征。是2010年和2011年首次报道的观察结果:(i)在转移性肺癌患者中,与对照组相比,197个血小板基因被下调并且几个基因被差异剪接[88];(ii)在胶质瘤中,血小板主动吸收癌症来源的微泡并转移其RNA,微阵列显示其具有癌症RNA特征。 2015年,Best等人使用RNA-Seq技术从患者中提取六种癌症类型的TEP,用于区分患有局部或转移性肿瘤的患者与健康个体,其准确率为96%,且肿瘤解剖位置的定位准确度达71%。这为“泛癌和多类癌症诊断”铺平了道路。在最近的工作中,将粒子群优化(PSO)增强算法应用于血小板RNA-Seq文库以生成一组生物标记物,用于区分患有肺癌的患者、有肺部炎症的患者以及健康个体。

循环肿瘤衍生的蛋白质

循环蛋白标志物的测量历来是癌症管理中非侵入性诊断、筛查和术后随访的金标准。 循环肿瘤衍生蛋白标志物的典型例子有用于前列腺癌筛查的前列腺特异性抗原(PSA)和用于乳腺癌复发术后随访的癌抗原(CA)15-3。 这些都会受到高假阳性率的影响,从而导至过度诊断,甚至导至不必要的抗癌治疗。CA 15-3在改善患者预后的应用中存在疑问。包含一种以上蛋白质组或生物印记的方法更可靠,因为多种生物标记物的组合可减少假阳性和假阴性,从而增强诊断和/或预后功能。


液体活检应用于癌症管理的争议

尽管液体活检可解决当前癌症管理的需求,但仍有许多关于其效用的争议,尤其是已经在临床管理中应用的ctDNA和CTC。最近报告显示,Torga和Pienta比较了两种商业化的NGS技术对转移性前列腺癌ctDNA的检测结果,发现两结果一致性较低(7.5%的患者)。归因于不同的研究设计和样品分析中的问题,强调了液体活检分析前和分析中标准化流程尚不完善。此外,除了少数例外,大多数晚期癌症的ctDNA分析缺乏临床有效性和实用性证据。同样,在早期癌症、治疗监测或MRD检测中的效用仍有待确定。此外,尽管已经证明CTC的临床有效性,尤其是在转移性疾病中的预后作用,但其临床效用的证据仍然缺失,限制了其标准临床实践中的应用。显然需要大量的大规模临床试验(目前有些正在进行)以解决未满足的需求。


结束语和未来发展方向

目前组织活检的肿瘤遗传改变,仍是指导患者分层和治疗选择的金标准。尽管组织活检具有显著的应用价值,但仍具有明显局限性,即高度进入性、无法捕获肿瘤克隆异质性。液体活检,包括循环肿瘤衍生因子(肿瘤循环组学),越来越受到人们关注。 肿瘤循环组学包括不同类别的肿瘤衍生物。新技术的开发旨在从检测抽血中获取复杂的信息,从而进一步改进肿瘤循环组学的分析。

本文强调了液体活检的应用潜力,新技术的发展能够更准确确定肿瘤循环组学中的每个单一组成成分。液体活检改变了个性化癌症管理模式。但它们受限于多种技术瓶颈,导至临床应用相对缓慢。因此,这些问题急需解决,以确定液体活检在临床环境中的作用(见下文重点问题)。该领域最大的限制是缺少分析前和分析变量的标准化制定。理论上,液体活检具有成本效益、快速、可重复,并确保样品完整性的特点。自动化芯片装置可实现该目的,可从全血中快速分析生物标记物,无需冗长且昂贵的纯化步骤。虽然芯片系统(例如ACE芯片)复杂且昂贵,但相较于聚合物微流体装置,例如用于CTC分离的螺旋微流体芯片,还是具有成本效益的。仍需大量工作来全面证实液体活检在癌症诊断、监测和预后中的作用,但目前的报道结果仍证明了液体活检在改变癌症治疗模式中具有巨大潜力。


重要问题

当现有技术检测不到ctDNA时,如何提高早期癌症中ctDNA的检测灵敏度?

能否针对异构CTC群体开发出一种全面的、无标记的、非破坏性的CTC分离方法?

能否针对肿瘤循环组学的每个成分制定出独有的“典型的”标准分离方案?

液体活查能否成为无症状早期癌症诊断的泛癌种生物标记物?






本文要点

循环EV、RNA和TEP是液体活检的新兴成分。

液体活检技术的发展有助于解决液体活检当前限制,并增强液体活检作为癌症生物标记物检测的灵敏度。




参考来源:

G De Rubis, et al. Liquid Biopsies in Cancer Diagnosis, Monitoring, and Prognosis. Trends in Pharmacological Sciences, Volume 40, Issue 3, March 2019, Page 172-186.

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