外泌体：肿瘤诊断新型标志物

外泌体的起源及生物学功能

1983年，Pan和Johnstone从网织红细胞培养液中发现了一种膜性小囊泡，并将其命名为外泌体。外泌体是一类直径约30～150 nm的磷脂双分子层纳米小囊泡，呈球形、扁球形或杯状结构，密度约为1.13～1.21 g/ml。外泌体是由内体途径生成，首先细胞质膜内陷形成内体，晚期内体膜进一步向内出芽形成管腔状囊泡，从而转变为具有动态亚细胞结构的多囊泡体 (multi－vesicle bodys, MVBs)。在这个过程中，胞质成分及跨膜蛋白等被收纳入囊泡之中。当MVBs与溶酶体融合后，其内的囊泡发生降解；而与胞膜融合后，其内的囊泡再次凹陷，以内出芽方式形成颗粒状小囊泡，并释放入细胞外环境，即外泌体。外泌体广泛参与细胞间物质运输与信息传递，调控细胞生理活动，在维持细胞内稳态及维持细胞间物质和信息交流中起重要作用。其次，外泌体具有抗原提呈、免疫逃逸等免疫调节作用。除此之外，外泌体具有诱导正常细胞转化，促进肿瘤发生及转移的作用，而且在传递肿瘤抗药性的过程中发挥着重要的功能。外泌体的特殊结构及生物学功能，对于寻找诊断肿瘤的新型生物标志物以及肿瘤的靶向治疗具有重要意义。

外泌体相关检测技术

外泌体相关检测技术目前主要包括分离纯化技术、物理特性鉴定技术及下游功能研究的分析技术。外泌体的分离纯化技术很多，包括超速离心、磁珠免疫捕获、沉淀及过滤等方法，差速离心法被认为是外泌体分离的金标准。外泌体的物理特性鉴定技术主要包括电镜观察、动态光散射及纳米微粒追踪分析以及可调谐电阻脉冲传感检测技术。最新研究中，通过使用超高灵敏流式检测技术实现外泌体的单颗粒定量分析，该技术能在单个外泌体中进行多项物理指标的测量，是研究外泌体物理特性的有力工具。外泌体蛋白质的分析技术主要有ELISA，蛋白印迹和质谱分析等；核酸的分析技术主要有二代测序、基因芯片、实时荧光定量PCR等。这些传统的蛋白、核酸分析技术在临床应用中都各有欠缺，目前还缺少足够灵活且快速的检测平台。随着液体活检技术的发展，人们在外泌体研究领域不断探索新的检测方法。

外泌体在肿瘤诊治中的价值

(一)外泌体促进肿瘤发生的分子机制

目前认为外泌体调控肿瘤发生的分子机制主要有以下几方面：(1)外泌体含有某种来源于亲本细胞的细胞特异性蛋白，可诱导T细胞发生凋亡并抑制机体的免疫反应。(2)肿瘤外泌体携带与肿瘤发生转移相关的分子可使受体细胞形成转移表型并可改变周围及远处组织细胞的正常生理状态。(3)大量生物活性分子可以通过外泌体与目标细胞膜融合转移到受体细胞并调节受体细胞的信号通路和蛋白表达。(4)肿瘤外泌体内部的蛋白酶可增加细胞的侵袭性。(5)肿瘤外泌体可诱导成纤维细胞生长分化，对肿瘤转移微环境中血管的再生起着重要作用。综上所述，外泌体通过激活肿瘤相关信号通路、诱导免疫耐受、重塑细胞外基质、增强肿瘤细胞侵袭性和调控肿瘤微环境促进肿瘤的发生发展，在肿瘤诊断与监测以及肿瘤治疗方面都表现出了强大的优势。外泌体与肿瘤的相关研究已成为肿瘤研究领域的热点。

(二)外泌体与肿瘤诊断

作为肿瘤分子标志物，外泌体在肿瘤诊断上的意义已经突显出来。由于外泌体具有许多天然的优势，例如：外泌体可保护其中的核酸类物质，防止其迅速降解；外泌体的形成与亲源细胞的状态密切相关；针对外泌体内容物的检测比传统的肿瘤标志物更具有特异性；外泌体广泛存在于多种体液样本中，以其为基础的肿瘤诊断可在病情发展过程中及时监测分子标志物的变化，这种检测更易监控且样本更易收集。这些都为外泌体真正用于临床肿瘤早期诊断开辟了一条重要的途径。瑞士日内瓦大学的研究人员发现恶性胆管狭窄患者胆汁中的外泌体浓度明显高于良性患者，建立的检测阈值对区分良恶性狭窄准确度高达100%，而血清外泌体浓度区分恶性和非恶性狭窄的准确性为63.3%。另有Exosome Diagnostics公司相继推出的产品标志着基于外泌体的肿瘤诊断向成熟更迈进了一步，2016年1月21日外泌体肿瘤诊断产品于美国上市，它可以灵敏、准确、实时检测非小细胞肺癌患者的棘皮动物微管相关蛋白4－间变型淋巴瘤激酶融合基因(echinoderm microtubule associated protein like 4－anaplastic lymphoma kinase，EML4－ALK)突变，敏感度88%，特异度100%，同时可检测外泌体中的RNA和循环肿瘤DNA (circulating tumor DNA，ctDNA)。2016年，该公司发布了全球首个利用尿液样本收集外泌体分析其遗传信息的液体活检试剂盒，可以帮助医生评估患者患高分级、侵袭性前列腺癌的风险并避免不必要的前列腺活检。2018年，该公司又研发了一项突破性成果，通过血浆外泌体信使RNA(messenger RNA，mRNA)和长链非编码RNA(long non－coding RNA, lncRNA)的检测实现乳腺癌的精准诊断。因此，外泌体检测可实现肿瘤的无创诊断，且以外泌体来源的内容物作为潜在标志物在肿瘤研究领域中占据了重要地位，见表1。

表1 外泌体内容物作为肿瘤的潜在诊断标志物

注：miRNAs为微小RNA，lncRNAs为长链非编码RNA，miR为微小RNA(miRNA的缩写)，KRAS为鼠类肉瘤病毒癌基因，HOTTIP为HOXA基因簇末端转录本，HOTAIR为HOX转录反义RNA，MALAT1为肺腺癌转移相关转录本1，MEG3为母系印迹表达基因3，Her2为人表皮生长因子受体2，NY－ESO－1为纽约食管鳞状上皮癌抗原1，GGT1为谷氨酰转移酶1

1．外泌体核酸：

外泌体核酸包括微小RNA(microRNA，miRNA)、mRNA、lncRNA以及DNA。外泌体的脂质膜结构可以防止内部miRNA的降解，其包含的miRNAs比细胞内miRNAs呈现出更高的浓度，因此外泌体miRNAs在肿瘤诊断方面具有很大的优势。研究证实外泌体miRNAs在肿瘤发生及发展中表达失调，且肿瘤患者与正常人群之间存在差异表达。Huang等通过对激素抵抗型前列腺癌患者进行RNA测序及qRT－PCR，对血浆外泌体miRNAs的临床价值进行了评估，结果发现外泌体miR－1290/miR－375有望成为激素抵抗型前列腺癌患者的诊断及预后评估的生物标志物。有研究者通过比较，发现肝癌患者的外泌体中富含miR－21且外泌体miR－21与循环miR－21相比检测敏感度更高。除外泌体miRNAs之外，来源于外泌体的mRNA和lncRNA等生物分子也在肿瘤的诊断中扮演重要的角色。研究发现长链非编码RNA——HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)主要存在于多形性胶质母细胞瘤患者血清外泌体中，可作为新型的诊断和预后生物标志物。另有研究报道外泌体中长链非编码RNA－HOXA基因簇末端转录本(HOXA transcript at the distal tip, HOTTIP) 在胃癌患者表达水平明显升高，可作为胃癌诊断和预后的潜在生物标记物。Yang等在多型性胶质母细胞瘤的研究中发现外泌体内的发动蛋白3(dynamin 3，DNM3)和p65 mRNA表达上调，可用于患者的诊断和治疗。由于传统的核酸检测技术灵敏度有限，最近涌现出很多外泌体核酸检测新技术，如微滴式数字PCR技术、微流控技术及分子信标技术等，进一步提高检测灵敏度并实现高通量的核酸检测，同时解决了传统核酸检测方法操作复杂的问题，在肿瘤诊断中显示出良好的临床应用前景。随着核酸检测技术的不断发展，外泌体核酸在肿瘤的无创诊断中将会起到至关重要的作用。

2．外泌体蛋白：

外泌体内包含有多种反映其亲本细胞特征的蛋白分子，可作为肿瘤诊断的分子标志物。2015来自美国M.D安德森癌症中心研究者们通过大量的胰腺癌患者血清样本分析发现，相比正常人，胰腺癌患者血清中磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(glypican－1，GPC1)阳性的外泌体占比显著增高。进一步研究发现，GPC1阳性外泌体在早期胰腺癌患者的血清中丰度显著高于正常人群，能够以100%的准确性和敏感性诊断早期和晚期胰腺癌，这一发现可能会给胰腺癌患者的命运带来颠覆性的改变。研究发现通过检测外泌体中的细胞外基质蛋白发育内皮基因1 (developmental endothelial locus－1, Del－1)表达水平可以提高早期乳腺癌的识别能力，并将恶性乳腺癌与良性乳腺肿瘤和非癌性疾病区分开。Huang等研究发现胶质瘤患者血清外泌体中聚合酶Ⅰ转录释放因子(polymerase Ⅰ and transcript release factor, PTRF)与肿瘤分级正相关，可作为肿瘤诊断的生物标志物并可能成为治疗靶标。有研究通过液相色谱/质谱联用法系统地比较了健康志愿者和肺癌患者的唾液和血清外泌体蛋白质组并鉴定差异表达蛋白，潜在标志物的发现为肺癌的诊断提供了依据。近期，国内一项研究成功构建了基于质谱的等离子金芯片，可用于外泌体的代谢指纹识别及大规模诊断。

3．外泌体脂质及小分子代谢物：

外泌体中的脂类分子主要用以维持其外部形态，并可作为信号分子参与肿瘤的生物学过程。澳大利亚研究人员通过高通量质谱定量脂质组学分析在前列腺癌患者和健康对照人群的尿液与细胞培养液外泌体中存在的几种差异脂质，进一步证实外泌体脂质在前列腺癌中具有诊断价值。芬兰赫尔辛基大学的研究人员探究了前列腺癌患者前列腺切除术前和术后患者尿液和血小板外泌体中的小分子代谢物水平，结果显示外泌体中的小分子代谢物与肿瘤发生发展相关。

(三)外泌体与肿瘤治疗

外泌体具有理想药物载体的优点，可逃避宿主免疫系统，易于吸收，循环半衰期长。此外，外泌体装载大量生物学活性物质，在体液中广泛分布且具有定向归巢能力，用于载药具有更多的优势。目前，外泌体已经成功运载基因类药物、抗癌药物、抗炎药物及其他类型药物。美国犹他大学报道了一种基于外泌体的自组装蛋白质纳米笼的设计，可与靶细胞融合并递送其内容物，该方法在药物递送方面有很重要的应用前景。近期，美国M.D安德森癌症中心利用外泌体作为RNAi的有效载体进行胰腺癌的治疗，结果显示可以抑制肿瘤生长并显著延长总生存期。这些研究为外泌体载药体内肿瘤治疗奠定了基础，外泌体载药将会成为肿瘤治疗中的利器。

结语与展望

液体活检作为一种非侵入性的疾病诊断方法，已成为当前无创性临床诊断的研究热点，以外泌体为基础的液体活检是未来肿瘤分子诊断发展的方向。作为脂质双分子层的天然囊泡，外泌体是一种良好的药物载体，在肿瘤治疗方面具有巨大的开发潜能，为肿瘤的个体化靶向性治疗提供了研究策略。当然，在当前外泌体的研究中我们还面临着很多问题，例如：(1)外泌体的提取方法金标准仍然是差速离心法，但是这种方法费时费力且提取效率较低，难以进行临床推广和应用；而商业化的试剂盒质量参差不齐，往往导至提取物杂质过多，而且其售价较高。(2)外泌体的定量是采用颗粒浓度定量，蛋白浓度定量，亦或是核酸浓度定量？目前仍存有争议。(3)由于传统的内参并不适用于外泌体，那么在实时荧光定量PCR检测靶分子含量时内参的选择尚没有统一的标准。(4)外泌体分子标志物的研究还处于初级阶段，距离临床应用仍有一定距离。(5)目前外泌体研究的整个流程中成本都很高，从一定程度上限制了它的研究和临床应用。但是相信随着外泌体标准化分离提纯及检测平台的建立，外泌体在肿瘤的诊断和治疗领域将具有非常广阔的应用前景。