浅谈MALDI TOF MS 在微生物鉴定和诊断中的应用

前言

20世纪初，质谱技术作为一种分析技术，开始应用于化学科学领域，到20世纪90年代，基质辅助激光解析电离（Matrixassisted laser desorption/ionization, MALDI）和电喷雾电离（Electrosprayionization, ESI）两种软电离技术的出现，使得质谱能够对生物大分子进行微量分析。与ESI MS相比，MALDI生成的是单电荷离子，数据更易于分析，且在分析前无需色谱分离，因此具有高通量、快速、完全自动化的特点，广泛用于蛋白质组学的研究中。

MALDI TOF MS通过对完整细胞或细胞提取物的分析完成微生物的鉴定，不仅具有快速、灵敏和经济的特点，且在技术上易于被微生物学家接受，可用于许多目的，如微生物鉴定、菌株分型、流行病学研究、生物战剂检测、水和食源性病原体的检测、抗生素耐药性的检测、血和尿道病原体检测。这种方法的不足之处在于用于鉴定新的分离物时，图谱数据库中必须包含相应的属/种/亚种/株的多肽指纹图。

原理与方法

MALDI TOF MS 的基本原理是将样品与过量的小分子基质的混合溶液点加在样品的靶盘上，待溶剂挥发后形成共结晶，用激光照射晶体时，基质分子吸收能量与样品解吸附并使其电离，通常是基质上的质子转移到样品分子上。采用不同的质量分析器，如四级杆质量分析器、离子肼分析器、飞行时间分析器等检测带电荷的分析物，从而获得样品的质量信息，微生物鉴定通常采用飞行时间分析器（time of flight）。

MALDI源产生的样品离子根据t=const.(m/z)1/2(t为离子飞行时间，const为常数，m为离子质量，z为离子所带电荷)，通过检测飞行时间确定离子的质荷比，最后利用质荷比对样品进行定性和定量。MALDITOF MS 中最常用的是氮激光源，波长为337nm 。也有用红外激光即铒/镱-铝-石榴石（Erbium/yttrium-aluminium-garnet, Er-YAG）激光，波长为2.94um。

基于TOF获得的分析物特征图谱称为多肽指纹图（PMF）。MALDI用于微生物的鉴定时，或者将未知微生物的多肽质量指纹图（peptide massfingerprint, PMF）和数据库中的指纹图进行比对，或者将未知生物的质量生物标志分子与蛋白质组数据库进行比对完成。

样品准备

在样品准备方面，不同的微生物需采用不同的样品准备方法，样品不做任何处理，直接涂到样品板上，晾干后再点加基质溶液，或肉汤与基质溶液直接混合分析，但是只有选择合适的基质和溶剂才能获得有意义的图谱；用于微生物全细胞裂解物或天然细胞提取物的分析时则需要进行样品制备。

许多有机化合物可用作基质，但是用于微生物的鉴定，α-氰基-4-羟基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamicacid,CHCA），2,5-二羟基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoicacid, DHB），和3,5-二甲基-4-羟基肉桂酸（3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid, sinapinicacid）最为常用。

基质溶液包括水，有机溶剂的混合物如乙醇/甲醇、乙腈和强酸如三氟乙酸（TFA），能够溶解基质。溶剂能够穿透微生物的细胞壁，提取细胞内蛋白质。当溶剂挥发，蛋白质分子和基质溶液内的其他细胞化合物形成共结晶。

鉴定方面

应用MALDI TOF MS完成样品分析时，对于微生物种水平的鉴定，典型的质量范围为m/z 2-20kDa，主要是核糖体蛋白和一些看家蛋白。用于鉴定特定的微生物通常质量范围为m/z 2-10kDa，获得的结果与可扩展开放数据库中包含的核糖体蛋白PMFs进行比对，可鉴定微生物到属的水平，许多情况下甚至鉴定到种和株的水平。

由于这种方法比较简单，微生物诊断实验室容易开展此项工作，利用许多生物PMFs的商业数据库，广泛应用于微生物鉴定领域。由于创建预测蛋白质分子量的数据库之前需要获得生物的全基因组序列，微生物诊断实验室很少采用比对生物标志物的质量与基因组序列预测的蛋白质的分子质量来完成微生物的鉴定。

数据库系统

数据库系统是MALDI平台的关键组成部分，微生物专业数据库的开发使得MALDI TOF MS成为非常有价值的微生物鉴定工具。第一代用于微生物鉴定的MALDITOF MS系统是Bruker Daltonics开发的MALDIBiotyper。MALDI Biotyper包含基本的MALDITOF 平台、操作和分析软件、数据库和样品提取/制备系统。软件和数据库易于与Bruker MALDI TOF仪器及相关的操作和分析软件整合，且支持自建数据库。

另外一个微生物鉴定MALDI平台由Shimadzu与bioMérieux合作开发，Shimadzu提供仪器和分析软件 “Launchpad”，而bioMérieux 提供和维护中心数据库“SARAMIS”，可以升级。后来，Andromas 引进了一种不同于上述两种类型的数据库和软件，其与Bruker和Shimadzu的仪器兼容，用于常规细菌鉴定。在MALDI TOF MS 发展过程中的一个里程碑事件是监管机构批准其可用于临床细菌和真菌的常规鉴定。

在刚刚过去的几年中，MALDIBiotyper CA 系统(Bruker Daltonics Inc.)经美国FDA批准用于人标本培养的细菌鉴定（体外诊断），而VITEKR MS(bioMerieux Inc.)也经美国FDA批准用于培养的细菌和酵母的鉴定。2012年，中国首次批准将MALDI TOF MS应用于临床，国家FDA批准bioMérieuxVITEK MS 系统用于体内诊断（invitro diagnostic）。后来，国家FDA也批准Bruker IVD MALDI Biotyper用于人标本分离到的微生物的常规鉴定。

总结

商业化MALDI 平台的生物数据库系统包含的微生物种类非常多，几乎包含了所有代表性的微生物，使得结果具有可比性，假阳性率极低。有些基于MALDI的鉴定研究中，出现不能鉴定的情况，原因可能是早期的数据库中不包含这些生物，而不是方法学错误。

遗憾的是，由于这些数据库和软件的价格太高限制了个体研究者的使用。而现在有研究者开发出开放性的数据库和软件，有mMASS，Mass-Up，pkDACLASS，MALDIquant，SpectraBank，BioSPLEAN等等，可免费用于科学领域，部分弥补了此缺憾。

相信随着更多数据库和软件系统的开发、完善和升级，MALDI TOF MS将成为微生物鉴定领域非常重要的技术工具和手段。

作者简介

刘海洪，女，博士学位，毕业于军事医学科学院微生物流行病研究所，微生物学专业。

目前所在单位及科室：北京军区总医院儿科，工作期间主要负责遗传代谢病的筛查和诊断工作。