一文吃透mNGS去宿主的得与失

mNGS 的应用带火了诸多病原体，也催生和普及了许多专业名词，如序列、覆盖度、深度、比对等概念。去宿主便是众多专业名词中的一个亮眼存在。顾名思义，去除宿主，即去除干扰病原体检测性能的宿主细胞或宿主序列。如果是临床宏基因组测序，宿主便是人源细胞、核酸和测序序列；如果是用于动物病原的宏基因组测序，宿主则是对应动物的细胞、核酸和测序序列。

一、去宿主的应用场景及原理概述

具体到去宿主的应用场景，湿实验和干实验都会涉及去宿主。湿实验中，去宿主通常指去除宿主细胞或核酸。

去除宿主细胞通常有两种方法，一种是血液样本通过离心，分离出血浆层进行检测，降低人源白细胞及其产生的核酸对以病原体为测序目标的 mNGS 干扰；另一种是针对呼吸道等类型的样本，通过微米级别的滤膜过滤完整人源细胞，留存微生物细胞和胞外核酸进行后续检测。

基于操作步骤的顺序，去除宿主核酸的方法可分为核酸提取前和核酸提取后两类，这两类方法在呼吸道样本（肺泡灌洗液、痰液、咽拭子等）中应用最为广泛。

核酸提取前的去宿主大致有两类，详细见下方示意图：

第一类是直接使用生物酶降解呼吸道样本中裸露的游离核酸片段后，进入破壁、核酸提取环节。这是一种相对温和的去宿主方式，兼顾了“未知”样本中多种病原体的检测性能。

第二类方法的核心是差异裂解法。其原理基于细菌与人体细胞壁的耐受性差异：通过特定方式裂解宿主细胞，使其释放出人源核酸；而细菌、真菌等病原体则因其坚固的细胞壁得到保护，核酸不会被释放。待人源核酸释放后，再加入核酸酶降解释放的人源核酸，也可加入 PMA（叠氮碘化丙锭）选择性进入膜破损的细胞，与胞内的 DNA 交联，就可以留存带有细胞壁的、相对完整的病原体，进入后续的破壁及核酸提取环节。

这一方法是 mNGS 业内针对新鲜样本广泛使用的方法，其通过进一步裂解人源细胞去除基因组 DNA，降低其干扰。其中，裂解人体细胞的方法又可分为使用化学物质如皂素或加入低渗缓冲液，基于渗透压裂解人源细胞。相比上文提及的第一种仅酶解游离核酸的方法，第二类方法去除宿主核酸的干扰更强，对部分低载量病原（如结核、真菌等）效果更佳。

还有一种是上述两大类方法的结合体，即基于人体细胞和微生物细胞的大小不同，先使用特定微米的滤膜首先过滤人源细胞，再用核酸酶降解裸露的游离核酸，紧接着进入针对微生物的破壁环节。

部分去宿主方法原理示意图（后文参考文献1）

核酸提取后的去宿主基于人源核酸存在甲基化，而多数微生物的甲基化水平远低于人源DNA。可以通过抗甲基化 DNA 磁珠结合甲基化的人源核酸，进而反向富集微生物。但革兰阳性菌、部分真菌、寄生虫仍存在甲基化，导至此类病原微生物的检测性能降低。

在干实验环节，当测序完成后，单个样本中产生的数据依然绝大部分是人源宿主序列，通过将测序序列与人源宿主数据库比对，进而去除人源宿主，也是一种去宿主的实践。不过，随着 mNGS 的广泛应用，临床口语里的“去宿主”多指湿实验，生信专家说的“去宿主”则常指比对过滤，二者同名不同事。但是，目前大家广为人知的去宿主大多特指湿实验环节的去宿主。这可能与每天大多数呼吸道样本都要经历和切身体验去宿主环节有关。而干实验环节的去宿主通常是脚本的一部分，不能直观被感知。

二、去宿主应用现状：被忽视的 RNA 流程去宿主

如果说 DNA 流程的去宿主方式主要集中在提取前，即先后历经去宿主、破壁、核酸提取、文库构建上机的湿实验过程，那么 RNA 流程的去宿主则主要集中在核酸提取后的文库构建环节。

RNA 流程的重点目标是具有致病意义的 RNA 病原。呼吸道常见的 RNA 病毒包括流感病毒、新冠病毒等，也包括血流感染常见的登革热病毒、基孔肯雅病毒等。另一方面，RNA 病毒基因组小，容易发生变异，是最容易出现新发物种，并潜在可能导至感染大流行的病原体类型。前几年，RNA 病毒检测方法不如现阶段多样，加之 RNA 病毒检出后，通常可选择的有效药物非常有限，因此临床对 RNA 病毒重视不足。

体现在实验环节，一些检测单位因为时效性、成本等因素不进行RNA流程的去宿主（即rRNA去除）以及用于去除DNA残留的DNA酶（DNase）消化步骤，导至 RNA 检测性能较差。毕竟临床可验证的较少，RNA 病毒检出意义弱于细菌、真菌等。如今，随着新冠的大流行以及研究的深入，提升 RNA 病毒的检测能力是必须且需进一步重视的。

然而，一方面，上文提及的许多去宿主方法（如差异裂解、滤膜过滤）主要针对有细胞结构的病原体，其对无细胞结构的病毒效果有限。另一方面，RNA 病毒较为脆弱，轻微的化学物理处理会导至其检测性能的降低。因此，宏基因组要有效检测 RNA 病毒，需要降低常规 DNA 去宿主技术对 RNA 病毒破坏的可能，同时兼顾其检测性能，怎么做呢？

答案是，聚焦在提取后的宿主去除，即去除提取好的总 RNA 中占 80% 以上的核糖体 RNA（rRNA），其原理是：用特异性探针与 rRNA 杂交，然后用 RNase H 酶直接消化 rRNA，或者链霉亲和素磁珠捕获杂交好的 rRNA 来反向富集其他 RNA。还有一种方法是通过高亲和力的核酸片段与 rRNA 杂交，封阻其反转录，进而实现 mRNA 等目标 RNA 的富集。当然，提取好的 RNA 核酸去宿主后核酸含量骤降，产生的微量核酸如何成功建库是检测单位要面临的核心挑战。

三、去宿主为什么是 mNGS 的推荐必备环节

既往章节我们曾提及，人源是 mNGS 灵敏度的主要干扰因素。人源宿主含量越高，同等条件下对应的病原微生物的灵敏度就越低。人源宿主含量高体现在两个方面，首先这是一份取自人体的样本，毫不意外，肯定存在人源细胞。当然，不同部位采集的样本人源含量不同。

其次，人的单倍体基因组是 3 G，也就是 3×10⁹ 个碱基，而常规病原微生物，以细菌为例，通常是 3-5×10⁶ bp（base pair，碱基对），两个差异 100 万倍，这还是人的单倍体基因组对应一个细菌的情况下。在测序中，物种基因组越大，被测到的概率就越高。

样本中人源细胞不仅数量众多，而且相比于细菌基因组来讲，都是巨人般的存在。测序得到的数据中，人源序列极端情况占比 99.99%，病原体序列仅有 0.01%，就毫不为怪了。

这也是为什么在 mNGS 开展前的性能确认以及国家临检中心室间质评的考核中，模拟样本中会加入不同梯度的人源核酸来评测第三方机构/医院 mNGS 的灵敏度。如果不去宿主，就好比在麦草堆里寻针一样，放眼过去，测到的都是满眼的人源序列，找寻病原序列极其困难。

测序资源是有限的，有成本要求，而人源序列与病原微生物序列存在竞争关系。因此，通过前处理降低人源细胞、核酸的干扰，在同样资源下，病原微生物就有更多被测到和被识别的机会，对应的检测敏感性也会提高。

四、去宿主的收益与损失

首先毋庸置疑，去宿主是提高 mNGS 灵敏性的有效解决方案，它可以降低人源细胞与核酸的干扰，进而反向富集、提升病原体的序列数与覆盖度，同时富集病原体种类与关键功能基因，如耐药、毒力基因以及低丰度病原的检测性能。因此，最近的文献指出，即使联合去宿主后，mNGS 的菌种构成可能会有偏移，但依旧推荐 mNGS 进行去宿主。原因是，现有测序数据量下，如果不用去宿主技术，将会严重低估呼吸道微生物的多样性（详见后文的关键参考文献）。

不过，去宿主效果会与样本类型（痰液、肺泡灌洗液、拭子等）、样本状态（新鲜、冷冻或模拟样本）、技术路线等密切相关。该技术的引入同时会带来试剂背景污染、部分物种丰度改变。例如，降低了微生态细菌如普氏菌、条件致病菌铜绿假单胞菌、无细胞壁的病原体肺炎支原体的相对丰度。对于临床 mNGS 的诊断来讲，就需要注意此类病原的漏检或漏报可能。

上述提及多种去宿主方案，那到底要不要去宿主以及哪一种去宿主方案最佳呢？在临床诊断场景来看，要不要去宿主以及去宿主方法的选择是一个综合因素的选择，即去宿主效能、操作友好性、成本与时间等多种因素。有些检测单位可以为了操作友好性，不进行 DNA 流程的去宿主；有些检测单位可以为了检测性能，对不同样本选择最匹配的去宿主方式，但显著增加了操作的复杂度；有些检测单位考虑成本和时效性以及临床对病原体的已有认知，不进行 RNA 流程的去宿主。这些都是基于不同优先级（如性能、成本、效率）做出的选择，并无绝对的对错，但都伴随着相应的收益与风险。

另一方面，有研究曾指出包括酶解胞外游离 DNA 的方法可以真实展现皮肤活菌组成。背后的潜在原因是包括差异裂解法、滤膜法在内的多种方法都是预先使得人体细胞破裂或人体细胞过滤，再使用核酸酶降解人源基因组核酸以及游离核酸。理论上，进入破壁环节的样本中主要是完整的活病原，侧面可以反映呼吸道样本活菌的组成。因此，这些方法有助于富集完整的微生物，可能更倾向于反映样本中活性较高的微生物群落构成。但这一效果需要针对呼吸道样本进行更多研究来验证。

从笔者经验来讲，基于 mNGS 本身受人源宿主这一极大因素影响的背景，去宿主是当下的主流。但是行业人士应该意识到其带来的风险，比如上述提及的部分病原丰度降低，操作相对更复杂等。不去宿主，意味着更多潜在病原的漏检与性能不佳，这对于以质量为基准的临床实验室是极大的风险。

具体到去宿主方式而言，上述提及的去宿主方法有一定的适用场景。例如，只有核酸酶消化的去宿主方式可能相对温和，如果在引入皂苷差异裂解宿主细胞的情况下再加核酸酶消化，可能更为有效。最近新发表的文献指出，滤膜过滤人源细胞和核酸酶消化胞外核酸的效果更佳，但该研究使用的样本为冷冻样本，且滤膜过滤这一操作本身不甚友好，在临床诊断应用场景也需要评估。

五、tNGS 需要去宿主吗？技术路线决定前处理策略

这是一个需要“分情况讨论”的问题，其答案完全取决于 tNGS 所选择的技术路线：是扩增子 tNGS，还是探针捕获 tNGS。

对于扩增子 tNGS 而言，答案是基本不需要。其核心原理是利用成百上千对引物，对目标片段进行 PCR 扩增。这个过程好比在巨大的信息海洋中进行“精准钓鱼”，引物就是特制的鱼饵，只会与目标病原体（鱼）结合。海量的宿主核酸（海水）虽然存在，但由于无法与引物结合，因此不会被扩增，在整个检测流程中近乎“隐形”。也正因省去了去宿主这一复杂步骤，扩增子 tNGS 的流程相对简化，成本也更具优势。

而对于探针捕获 tNGS，答案则是强烈推荐。探针捕获技术虽然也是正向富集，但它更像是用一张大网去“捞取”所有疑似的目标片段。虽然探针的设计有倾向性，但其杂交捕获过程与非目标序列的非特异性杂交以及磁珠的非特异性吸附，仍会“捞”上大量的人源宿主核酸。

尤其在宿主背景极高的样本中，如果不进行去宿主，宝贵的测序资源仍会被大量人源序列占据，从而影响对低载量病原的检测灵敏度。因此，“去宿主”+“探针捕获”的组合拳，通过双重富集，能最大限度地提升信噪比，是确保其高性能表现的关键环节。

总而言之，是否需要“去宿主”，并非一个可选项，而是由技术底层逻辑决定的必然选择。扩增子路线的“精准”使其能无视宿主干扰，而探针捕获路线的“广捞”则决定了它必须先通过去宿主来筛选掉大部分干扰，才能实现最终的高效检测。

六、结语

从临床样本中检测疑似病原体，本质上是一场信噪比的博弈。宿主，是我们探寻病原的“背景板”，也是这场博弈中最大的“噪声源”。去宿主技术的探索与优化，都是为了让病原这种微弱信号能被更清晰地听见，同时尽可能客观反映样本中的微生物构成。

然而，任何一种方法与选择都伴随着收益与代价：我们既要大胆地去除干扰，又要小心翼翼地保护那些脆弱、罕见的“真凶”不被错杀。这趟在海量宿主中寻觅病原的旅程，目前没有一劳永逸的最优解，其应用始终是检测性能、操作成本、流程复杂度和特定病原体需求之间持续权衡与精进的结果。技术的进步，正是在这一次次取舍与优化中，离真相更近一步。

您所在的实验室 NGS 用去宿主了吗？在使用哪种去宿主方式？欢迎留言~

部分参考文献：
1.Wang, C., Zhang, L., Kan, C., He, J., Liang, W., Xia, R., Zhu, L., Yang, J., Jiang, X., Ma, W., Liang, Z., Xiao, Z., Zhang, J., Zhong, J., Sun, X., Chang, D., Wang, Z., Zhang, G., & Li, M. (2025). Benefits and challenges of host depletion methods in profiling the upper and lower respiratory microbiome. NPJ Biofilms & Microbiomes, 11, Article 56.

2.Kim, M., Parrish, R. C., II, Tisza, M. J., Shah, V. S., Tran, T., Ross, M., Cormier, J., Baig, A., Huang, C.-Y., Brenner, L., Neuringer, I., Whiteson, K., Harris, J. K., Willis, A. D., & Lai, P. S. (2024). Host DNA depletion on frozen human respiratory samples enables successful metagenomic sequencing for microbiome studies. Communications Biology, 7, 1590.

3.Amar, Y., Lagkouvardos, I., Silva, R. L., Ishola, O. A., Foesel, B. U., Kublik, S., Schöler, A., Niedermeier, S., Bleuel, R., Zink, A., Neuhaus, K., Schloter, M., Biedermann, T., & Köberle, M. (2021). Pre-digest of unprotected DNA by Benzonase improves the representation of living skin bacteria and efficiently depletes host DNA. Microbiome, 9, Article 123.