可以毫不夸张的说，光学检测技术几乎统治了我们常见的实验仪器，而咱们行业中最常见到有三种发光，分别是生物发光、化学发光以及荧光，今天来聊聊他们的原理及应用。一般来说，由活体生物体内的荧光素酶催化底物荧光素氧化，并将化学能转化为光能，且这个过程需要ATP（三磷酸腺苷）的参与，这个不需要外界光源参与的过程被称为生物发光。 （海肾）这个发现过程恰恰是科学对世界认知的一次实证，当时科学家为了弄清楚萤火虫的发光原理，在20世纪40年代左右，其原理终于被揭晓。科学家在萤火虫体内提取出了荧光素酶（催化酶）和荧光素（底物）两种关键物质，并阐述了整个过程，发光机制被破译，即荧光素 + ATP + O₂ → 氧化荧光素 + CO₂ + 光。随后，其他科学家成功解析了萤火虫荧光素的完整化学结构，并实现了人工合成，这使得它能够作为商业试剂被广泛使用，最常见的场景如下。报告基因检测： 将荧光素酶基因连接到目标基因的启动子后面，一旦目标基因被激活表达，就会同时表达荧光素酶，加入底物后就会发光，发光强度直接反映目标基因的活跃程度。在此应用中，萤火虫和海肾发光体系无疑是当之无愧的代表，两者的组合成就了一段试剂“佳话”--双报告基因系统。体内成像： 将表达荧光素酶的细胞或微生物植入小鼠体内，通过注射底物荧光素，可以用高灵敏度相机观测肿瘤生长、感染进程、基因表达位置等，是一种强大的非侵入性活体成像技术，可以无创、实时地在活体动物体内追踪肿瘤转移监测、基因表达、观察感染过程、评估药物效果。ATP含量检测： 由于反应需要ATP，发光强度与ATP浓度成正比，因此可用于检测细胞活性、微生物数量（如细菌污染检测）。所谓化学发光，专业解释为两种或多种化学物质发生氧化还原反应，产生一个处于激发态的中间体，当这个中间体回到基态时释放出光子，其发光能量来自于化学反应中释放的能量，即化学能。这个过程分为两种，直接发光和间接发光。直接发光是最简单的化学发光反应，其标记物（如吖啶酯）自身具有发光基团，在免疫反应后，仅需加入碱性溶液和过氧化氢等氧化剂，即可直接发生发光反应，无需催化剂。间接发光其标记物是酶（如ALP或HRP）。免疫反应后，加入相应的发光底物（如ALP对应AMPPD，HRP对应鲁米诺），酶催化底物反应并产生光信号，又称酶促化学发光。在化学发光体系中，目前常用的直接发光标记物有鲁米诺类和吖啶酯类，间接发光有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），发光底物以鲁米诺、AMPPD为代表。此应用中最为普及的当属与免疫相结合的分析检测手段，行业内称为化学发光免疫分析方法（CLIA），另外在科研实验里，蛋白电泳转印后通过ECL化学发光试剂盒检测则是最为常用的。Western Blot（蛋白免疫印迹）： 最经典的应用，用HRP标记的二抗与目标蛋白结合，加入化学发光底物后，HRP催化底物发光，通过曝光或化学发光成像来检测蛋白条带。ELISA（酶联免疫吸附测定）： 与Western Blot类似，用于检测溶液中的抗原或抗体，发光信号代替颜色信号，灵敏度更高，在体外诊断商业化已非常流行。我们平常所说的“荧光”其实是一个广义的概念，有些物质在入射光撤去后仍能较长时间发光，这种现象称为余辉，而真正的荧光，是一种光致发光的冷发光现象。荧光与前两者最大的不同在于，它需要外光源激发，通过吸收光子获得能量（前两者是化学能），外源光停止后，荧光会立刻消失，其原理是荧光是短波长的光激发，电子从基态跃迁至激发态，激发态不稳定，电子需要重新回到基态，这时损失的一部分能量，会以荧光的形式呈现。市面主要采用GFP、RFP或荧光染料进行标记，用荧光蛋白或染料产生的荧光就可以形成体内的荧光光源。这种常见的染料有异硫氰酸荧光素(FITC)、羟基荧光素(FAM)、Cy3、Cy5等，另外还有GFP（绿色荧光蛋白，可以通过其基因插入到目标物）。常见应用如QPCR中的荧光染料，Qubit仪器的核酸定量，二代测序仪器等。这种荧光染料一般使用比较简单，也比较便宜，但最大的麻烦在于背景噪声大，难以去除。
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