测序技术原理

一、一代测序技术（Sanger测序）

原理：
一代测序（Sanger测序）基于双脱氧核苷酸终止反应（dideoxy chain termination）。在反应体系中，使用正常的脱氧核苷酸（dNTP）和掺入少量双脱氧核苷酸（ddNTP）。当ddNTP被整合进DNA链时，会导至链的延伸终止，因为ddNTP缺乏3'-OH基团，无法再与下一个核苷酸连接。

1. 反应过程：

• 将目标DNA片段和引物加入反应体系。

• 在四个独立反应中分别加入不同的ddNTP（A、T、C、G）。

• DNA聚合酶以正常dNTP延伸DNA链，但一旦掺入ddNTP，链的延伸会终止。

• 每个反应最终得到不同长度的DNA片段。

2. 测序检测：

• 将各反应的产物通过电泳分离，根据片段大小推测每一位点的碱基种类。

• 使用放射性标记或荧光染料标记的ddNTP进行检测，现代Sanger测序采用荧光标记，不同颜色代表不同碱基。

特点：

• 精度高（99.99%），适合小片段测序（≤1000bp）。

• 测序成本高、速度慢，不适用于大规模基因组项目。

二、二代测序技术（Next-Generation Sequencing，NGS）

原理：
二代测序采用高通量平行测序，即将大量DNA片段同时测序。与Sanger测序不同，二代测序不需要逐个读取，而是通过模板扩增、序列拼接和信号检测进行数据读取。

1. 步骤：

• 样本准备：将基因组DNA剪切成小片段，并加上特定的接头序列（adapter）。

• 模板扩增：通过桥式PCR或乳液PCR在固体基质上扩增DNA片段，形成簇。

• 测序反应：以**边合成边测序（Sequencing by Synthesis，SBS）**方式进行，DNA聚合酶在合成时加入荧光标记的核苷酸，每加入一个碱基，检测器捕获荧光信号。

• 信号读取：每一轮测序记录一次荧光信号，将所有轮次的信号汇总，即可得到对应的DNA序列。

2. 代表平台：

• Illumina（常见，精度高，适用于全基因组测序）。

• Roche 454（已淘汰，但曾用于长片段测序）。

• Ion Torrent（基于pH变化检测碱基插入）。

特点：

• 高通量、低成本，适用于大规模基因组和转录组测序。

• 测序长度较短（100-600bp），依赖序列拼接算法，容易出现重复区域错误。

三、三代测序技术（Third-Generation Sequencing，TGS）

原理：
三代测序实现了对单分子的实时测序，无需大量PCR扩增，直接读取长片段DNA或RNA序列。这极大提高了读长，并减少了扩增带来的偏差。

1. 代表技术：

• 采用纳米孔技术：将DNA/RNA单分子穿过纳米孔道，通过检测电流变化读取序列。

• 优点是可直接测序RNA，且读长可达百万bp。

• 纳米孔测序设备小巧（如MinION），便于携带和现场测序。

• 利用**单分子实时测序（Single-Molecule Real-Time sequencing, SMRT）**原理。

• 在纳米孔腔室内，DNA聚合酶将碱基引入DNA链，碱基的电信号会被实时检测。

• 读长可达1万至5万bp，但错误率较高，通常通过重复测序纠正错误。

• PacBio测序（SMRT测序）：

• Oxford Nanopore测序：

2. 特点：

• 读长长，适合处理复杂区域（如重复序列、结构变异）。

• 可直接测RNA，减少反转录的误差。

• 错误率较高，但可通过重复测序提高准确度。

• 设备成本高，且分析处理需要较大的计算资源。

总结与对比

应用趋势：

• 一代测序：主要用于小规模基因测序、突变验证。

• 二代测序：是目前主流的高通量测序方法，广泛用于基因组学、转录组学、群体遗传学等研究。

• 三代测序：在复杂基因组测序、结构变异检测、表观遗传学和实时RNA测序中展示出巨大潜力。

各代测序技术的不断进步，使得研究人员能更快、更全面地探索生命科学中的未知领域。