三代测序学习笔记-技术起源4

2024-2-27 14:44| 编辑: 归去来兮| 查看: 1400| 评论: 0|来源: 科研诊断旁观 | 作者：yifu

摘要: 我们又必须对国产产品寄予希望

前言：

交叉着写点底层技术的文章吧；最近一直看纳米孔的老古论文，越来越觉得，技术的创新是那么困难，那么多课题组前赴后继，耗费了大量的精力和经费，往往也只是成为了后人的垫脚石，你根本不知道，技术创新何时能够量变到质变，也根本不知道你是否是那个上岸的幸运者；

国人科学仪器创新极少，metoo极多，固然有我们作为发展中国家本身底子弱、发展晚的必然因素，但如果基础科研继续没有严格的创新评判和激励，而产业经济调控、专利保护还是形同虚设的情况下，那劣币驱逐良币，创新必然没有土壤，行业必然极速内卷，待到安鸿遍野之时，国外的技术创新者又跨过了一条遥遥领先的新河，爬上了又一座我们必须仰望的高峰。

但是，我们又必须对国产产品寄予希望，特别是跨过专利封锁、走过技术无人区的孤勇者。专利封锁就好比是，这块石头我踩过了，你就不能这么轻松地直接再踩了，你只能绞尽脑汁在这块石头附件的水面下，再找一块石头，规划一个技术路径，说不定，走得比前人更好、更快呢！理解、成为、超越，必然是这个顺序。好比现在华大测序的G99在某些技术细节上，已经实现了超越。

而国内一堆看到illumina专利过期了，才开始跟疯的所谓国产NGS企业，结局不言而喻。

承接三代测序学习笔记-技术起源3，本文我们来讲讲接头的发明故事；附上《繁花》大结局的某段字幕截屏作为前言总结。

马达蛋白的优选及棘轮运作原理

而经过技术起源1、2、3的学习，我们应该都知道了，三代测序的必备组件是，膜，减速蛋白（即马达蛋白），纳米孔蛋白。这是三块大零件。

在三代测序学习笔记-技术起源3里面讲到，MspA最终因为更短的读点造成更特异性的性能取代了a-HL纳米孔蛋白，然后大肠杆菌膜表面孔蛋白CsgG又因为更收缩的孔内读点成为替代者，再之后CsgG和GsgF形成的融合孔道蛋白又因为形成了更独特的双读头结构，成为了更优异的候选者。

而其实马达蛋白的选择也不是一帆风顺的。

理所当然，马达蛋白肯定必须有和DNA/RNA有极佳的亲和力，又有着棘轮/齿轮般的结构功能。科学家一开始瞄着的就是天然的核酸酶类，大自然就是巨大的工具宝库，各种工具酶实在太多了，有一些公众号写得特别好，比如：用于“修饰核酸分子”的工具酶，“DNA聚合酶”都有哪些你知道么？；为了筛选可靠的工具酶类，比较知名的研究有：能结合单链DNA的大肠杆菌外切酶 I（Escherichia coli Exonuclease I ），能结合RNA的噬菌体phi8的APT酶（bacteriophage phi8 ATPase ），还有几种3'-5'外切酶活性缺失的DNA聚合酶如家族A DNA聚合酶（A-family DNA polymerases）、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段（Klenow Fragment ）、噬菌体T7的DNA聚合酶（bacteriophage T7 DNA polymerase， T7DNAP(exo-)）等。

在这篇垫脚石文章（研究T7和KF）中：Replication of Individual DNA Molecules under Electronic Control Using a Protein Nanopore；Felix Olasagasti1, Kate R. Lieberman1, Seico Benner1, Gerald M. Cherf1, Joseph M. Dahl1, David W. Deamer1, and Mark Akeson1,*，作者做了非常有意思且烧脑的方法学探索：

DNA聚合酶，即DNAP 好比是个送西瓜的猪八戒，这家伙有5′–3′ 的复制延伸能力和链置换能力，同是又有3′–5′ 的核酸外切酶活性（在Mg2+ 存在的情况下）。

因此这篇文章在西瓜上加了刺（设计一段1-2吖啶替换碱基的大部分碱基互补的寡核苷酸链，即阻断链），让猪八戒一开始无法去抱西瓜（造成空间位阻，阻止DNAP去结合核酸链）。并且在阻断链末尾设计一个7个非互补碱基的线头，这样在通过孔之后，就可以通过线头把阻断链撤掉。

然后通过复杂的缓冲液化学环境和正反电压的控制：穿过纳米孔，通过线头把阻断链撤掉脱落，带负电的DNA链通过纳米孔，但是控制好，不能都跑过去就完了！然后再反相电压，让核酸拉扯着DNA在纳米孔中反向移动，然后没有阻断链的保护下，DNAP又能结合上去，然后DNAP行使棘轮的功能，让DNA链再通过纳米孔。

可以想见，这种复杂的机制，带来了巨大的不可控性，难以使测序流程标准化、工业化。

还有一个问题是：T7DNAP(exo-)的确能组装在α-溶血蛋白（α-HL）纳米孔上，也能够在一定电压下将DNA运输到膜的另一端，但是施加电压后，很不稳定，降低了本来就困难的信噪比。

还有一篇垫脚石文章：Processive replication of single DNA molecules in a nanopore catalyzed by phi29 DNA polymerase，Kate R. Lieberman, Gerald M. Cherf, Michael J. Doody, Felix Olasagasti,
Yvette Kolodji, and Mark Akeson*。证明了phi29 DNAP 结合在纳米孔上的时间是家族A DNA聚合酶的10000倍。再结合phi29 DNAP本身的链置换活性（解链）和3'-5'外切酶活性，设计了两种过孔模式。

这两种机理看起来都不错，存在的问题是都需要依赖对核酸链3′末端进行化学保护：正常的3'末端是OH，而该文章发现如果3'末端是H的话，DNAP的3'-5'外切酶活性会被短暂地抑制。因此在这种条件下，供DNAP和核酸结合的时间窗口也仅有20min。这同样也是不适合商业化测序的。

踏过这两块垫脚石之后，一篇即将上岸的文章又发表了，这基本上是现在商业化测序的雏形了。这篇文章是：

该篇文章创造性地设计了一种全新的阻断引物，即让猪八戒抱着西瓜，但是下不去嘴。如下图b，25个碱基长度的阻断引物的5’端有两个吖啶集团，3'端同样也有非互补链的一个线头。下图c证明了这种结构的绝佳稳定性，在phi29 dNTPs （聚合酶延伸DNA的原料）和 Mg2+都存在的条件下，长达5h，保持不被DNAP的外切酶活性或聚合酶活性影响。

在后续的测试实验（下图a，设计了一种可以脱落的阻断引物）中证明，这种模式下，假设阻断引物不脱落，完全可以在电压力的驱动下，这个猪八戒被动地搬西瓜。如果阻断引物脱落，正常的3-OH被DNAP被猪八戒捕捉到，然后又可以开始复制（环境中假设添加dNTP和Mg2+）。

由此，证明了两种拉拉链的模式，一种是电压驱动，一种是复制驱动：

这篇文章是在α-HL上完成的，后续又有文章在MspA上复现了该结果：

这些踏脚石最终催生了以电压驱动过孔为核心的Oxford Nanopore 以及死在历史尘堆里的被罗氏收购的 Genia 纳米孔边合成边测序原理（类似 Pacbio，后面再讲）

最后我们看下纳米孔标准建库方法：

最后一步加tether，是个什么用途呢？该分子就像一个船锚，用于锚定DNA或RNA链，防止在溶液中飘动，并促使其进入纳米孔中。具体什么成分，不想花篇幅了，我猜应该是某种亲脂成分，查专利，查文献，果然如此。

也有文献专门研究此方法：

至此，零件拼图结束.

End.

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