东成西就——一部多线程发展的临床免疫检验技术史（中篇）

2022-11-9 15:32| 编辑: 归去来兮| 查看: 4434| 评论: 0|来源: 聚拓生物 | 作者：郑喜

摘要: 上一篇我们讲了经典免疫实验的发展阶段，那本篇就来聊一聊当代标记免疫的发展阶段。

引言

也许有人会问，为什么要去了解一个技术的历史呢？掌握最新技术不就所向披靡了吗？

很简单，任何一个技术的发展更迭从来都不是孤立的，都是在一脉相承的基础上做适当的创新而来的，甚至跨技术之间都可能是相互联系、彼此借鉴的。

有言道，学史可以知兴替，明得失。在当下临床免疫学检测技术蓬勃发展的局面中，不免困惑不同技术平台之间的本质性差异以及在具体应用中的优劣性。万变不离其宗，让我们通过梳理整个免疫检测技术的发展历程，来了解各个技术基业长青抑或兴衰更替的背后原因以及意义。

上一篇我们讲了经典免疫实验的发展阶段，那本篇就来聊一聊当代标记免疫的发展阶段。

放射性免疫

最先用于免疫诊断的标记技术是放射性标记。美国的罗莎琳和伯森是这个技术的发明者，也是灵魂人物。

1956年，罗莎琳和博森公开发表了关于放射性免疫测定的设想；接下来的三年时间里，他们把这个设想变成了可实施的操作方法，用于胰岛素的测定；并于1960年发表了他们突破性的实验成果。但当时，业界普遍认为这个技术太新，太复杂，不予采纳。

罗莎琳和博森并没有因此放弃，又用了几年的时间，培训科学家们使用RIA技术。到了1965年底，RIA终于成为众所周知的成功技术！并为罗莎琳赢得了1977年的诺贝尔生理学或医学奖的一半，获奖理由是“发明肽激素的放射免疫分析法”。

图罗莎琳·耶洛在实验室

这是第一个完全的定量测定方法，在免疫学发展史中具有里程碑意义。

RIA带来的革命性变化首先是糖尿病领域，而在接下来的研究中，扩展到了整个内分泌学和激素领域。基于严谨的实验和大量的数据，罗莎琳和伯森首次全面地阐述了人体中内分泌与激素的运作机理，如生长激素、甲状腺激素、促肾上腺皮质激素ATCH等，这极大地推动了内分泌学研究的进展。

因为罗莎琳和伯森坚持不为他们的发明申请专利，当时有相当多的商家和医院利用RIA技术赚得盆满钵满。

在放射免疫分析不断发展的半个世纪中，RIA检测品种多达近千种，覆盖各个领域。在国内，有三千多家医疗机构曾应用RIA检测技术，仪器市场保有量达近万台。2012年，中国放射免疫试剂市场规模约2亿人民币。即便是在化学发光出现后，早期因光信号持续时间太短，灵敏度甚至达不到RIA。

RIA的的优点是灵敏度高、成本低，缺点是同位素半衰期短，试剂盒不易储存，反应时间长而不利于自动化。而在RIA出现后的几十年中，平均每十年出现一种全新的免疫检测技术，以填补之前技术的短板。

酶联免疫吸附

1971年瑞典斯德哥尔摩大学的Engvall和Perlmann发展了一种酶标固相免疫测定技术，即酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)，定量检测兔血清中的IgG。同年，荷兰Organon公司的VanWeeman和Schuurs等以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP) 作为标记物，建立定量检测人尿中hCG的ELISA方法。酶联免疫吸附试验提供了快速、廉价、方便、无放射性污染的分析测定，虽然灵敏度低于RIA（约低10-100倍），但迅速地应用于各种生物活性物质及标志物的临床检测，并在临床应用中逐步取代了放免技术。

酶免疫测定技术（enzyme immunoassay technique，EIT）是以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂的免疫测定方法。在抗原抗体的特异性反应后，通过标记酶对底物的酶解呈色，根据呈色的深浅可以对相应抗体或抗原进行定性或定量测定。根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的酶标记物，可分为均相和非均相两类。

ELISA方法克服了传统RIA安全性的隐患，但其检测灵敏度和动态范围却受制于光吸收技术的固有缺陷，即溶液颜色变化对外部条件太敏感，并且OD值有效的线性范围过低。

其后，1972年Rubenstein等又建立了一种无需分离洗涤步骤的均相(homogeneous)酶免疫测定技术——酶放大免疫分析技术(Enzyme multiplied immunoassay technique，EMIT)，这种测定技术主要限于小分子物质如药物等的测定应用。

荧光偏振免疫分析

也在60年代，Dandliker曾开创性地建立了均相荧光偏振免疫分析方法（fluorescence polarized Immunoassay, FPIA），但早期的FPIA因缺乏专门的荧光偏振光分析仪器，荧光偏振光强度测定的精度和灵敏度不高，该方法一直没有得到发展和推广。

到了80年代初，Jolley等对FPIA方法做了改进，并将该法用于人体内治疗药物（氨基糖苷类抗生素）和毒物含量的测定。随后该方法才被逐渐推广应用，并增加了在临床检验、毒品分析、农药残留量分析、环境和食品监测等方面的报道。

到了80年代后期，Abbott推出了商品化TDx系列荧光偏振光分析仪，同时配有近百种分析试剂盒。

荧光偏振免疫测定（fluorescence polarization immunoassay,FPIA）是一种均相竞争荧光免疫分析法。

经激发光作用下发射出的荧光经过偏振仪形成偏振光，这一偏振光的强度与荧光素受激发时分子转动的速度成反比。游离的荧光素标记抗原分子小，转动速度快，击发后发射的光子散向四面八方，产生的光信号就弱；相反，与抗体大分子结合的荧光素标记抗原分子大，转动慢，光信号强。

因此，如果病人样本中的抗原浓度较低，与抗体结合的抗原就少，而荧光素标记的抗原与抗体结合的就多，经此竞争结合反应达到稳态后，则反应混合物中与抗体结合的荧光素浓度就高，偏振则强；反之，偏振则弱。

图雅培TDx血药检测仪，在90年代就卖到30多万

FPIA法的特点是：样品用量少，试剂稳定，使用寿命长，且安全环保；但灵敏度较非均相荧光免疫测定法低；主要适用于小分子、中等分子量物质检测，对本身分子量很大的物质不适合采用此方法。因此，曾是临床药物浓度检测的首选方法。

而从目前的眼光来看，在用药监测领域，TDx是很老的雅培的机器了，现在基本淘汰，据说早已停产，雅培主动推出了基于化学发光微粒子免疫分析技术的全自动免疫分析系统ARCHITECT i1000或i2000及配套试剂盒来做替代。

时间分辨荧光免疫分析

使用荧光素等传统荧光基团检测荧光强度 (FI) 时，荧光素的发射半衰期很短，大约只有数纳秒。样品的激发和发射光的检测会同时进行，因此会存在背景干扰。而时间分辨荧光可以很好的解决这个问题。

1979年，芬兰Wallac公司研发部的Soini和Hemmila首次提出了建立稀土离子标记物的“时间分辨荧光免疫分析”理论。

1982年Halon等人在J Clin Microbiol杂志上发表了题为“ Time-resolved fluoroimmunoassay: a new test for rubella antibodies” 的文章，标志着免疫检测正式跨入时间分辨荧光时代，这也是DELFIA技术的原型。DELFIA，即Dissociation Enhanced Lanthanide Fluorescence ImmunoAssay，解离增强镧系元素荧光免疫检测技术。　

1984年，Hemmila确定了DELFIA（解离增强镧系元素荧光免疫检测）这种时间分辨免疫分析技术方案，从而使DELFIA成为Wallac的专利技术。而目前Wallac正是珀金埃尔默位于芬兰的子公司。

值得一提的是，DELFIA技术为珀金埃尔默在新生儿筛查领域添上了浓墨重彩的一笔。在上个世纪末, 通过政府合作项目进入中国，是中国新生儿疾病筛查历史上具有里程碑意义的项目。从这个项目开始，国内确定足跟血作为新生儿筛查的检测样本。同时，中国通过各省市的实践经验陆续建立起新生儿足跟血采血的规范、实验室检测的技术规范、诊断治疗的规范。

时间分辨荧光 (TRF) 通过使用铕或铽等能够发射长半衰期荧光信号的镧系元素作为荧光基团来降低背景信号值干扰。这种长半衰期荧光信号可持续数毫秒，因此可以使用脉冲光源（如氙闪灯）激发荧光基团，隔一段时间再进行发射信号检测（“计数窗”）。短半衰期荧光（仅持续数纳秒）在信号检测之前就会消失。使用时间分辨荧光进行测定可大大降低信噪比。

另一特点是，激发光和荧光的波长位移大、荧光光谱峰窄，可有效消除激发光的干扰。

凡是用RIA或ELISA测定的物质均可以用本法测定。

DELFIA技术除了其为镧系元素标记，并且检测方式为荧光外，其它步骤与广泛使用的ELISA类似，且不需依赖时间的信号检测或添加终止液，但灵敏度和检测范围远高于ELISA，最大可达10-18 M，是目前常用的非放射性、非均相检测方法中灵敏度最高的检测方法之一。

但时间分辨荧光技术对检测设备和检测系统的要求特别高，仪器成本也特别高，在发光酶免技术发明后，对硬件和维护保养的要求也降低了，因此，时间分辨荧光技术竞争力减弱。

发光酶免疫技术

提高酶免疫分析的灵敏度一直是引人注目的问题。免疫分析的灵敏度取决于免疫反应的特异性和亲和力，以及标记酶的特异性和酶解产物测定的局限性等。当抗体和酶已经没有进一步改进的空间时，酶解产物的测定情况就对检测的灵敏度起决定性作用。在普通ELISA分析中，大多数的酶底物为生色底物，而如果把生色底物换成发光剂，通过发光反应发出的光进行测定，那么灵敏度要高很多，这就是发光酶免疫测定（luminescence enzyme immunoassay，LEIA）。

根据酶促反应底物不同，可以分为荧光酶免疫测定和化学发光酶免疫测定。

图荧光酶免疫测定（双抗夹心法）示意图

荧光酶免测定就是利用理想的酶荧光底物，生成的产物稳定并有较强的荧光，通过荧光强度测定进行定量；化学发光酶免测定就是利用酶对发光底物的催化作用而直接发光，通过光强度的测定而直接进行定量。

荧光酶免测定的代表产品有梅里埃的VIDAS，这是一款全自动POCT产品，已上市30年，其独特的试剂条设计如今已被许多POCT厂家借鉴。

想要了解全流程检测过程的，可以点击以下链接网页链接

化学发光酶免（也就是酶促发光）的产品就比较多了，在当前竞争最为激烈的发光免疫领域，酶促发光占了一席之地。如贝克曼、西门子、迈瑞的碱性磷酸酶（ALP）发光体系，安图的辣根过氧化物酶（HRP）体系。

图贝克曼ACCESS系列

图安图A2000

化学发光免疫技术

1976年Schroeder利用异鲁米诺标记生物素进行了化学发光测定。

90年代初，英国Amersham公司研究发现了发光稳定剂，能使发光信号持续20-30min，改善了化学发光检测的性能，随后生产出试剂盒，标志着化学发光技术开始进入了临床应用。

几乎同期，拜尔（前身为美国Ciba Corning公司）的全自动化学发光免疫分析系统ACS:180问世，采用了化学发光技术和磁性微粒子分离技术相结合的免疫分析系统，为第一台全自动化学发光分析仪，后来通过不断改进，实现了商业化推广。2006年拜耳诊断部门同美国DPC、德灵被西门子一同收购整合成西门子医疗诊断部门。

海外市场从80年代开始，发光逐步取代了放免和普通酶免。

而在国内，化学发光市场是在2003年拜耳的报到开启的，紧接着2004年贝克曼到来、2005年雅培紧随其后、2006年罗氏黄柏兴携Elecsys2010登场。

国产化学发光设备也在这个阶段才开始逐渐发展。一开始是半自动板式发光，如北京源德、科美东亚等。到2010年，产品开始迭代为全自动板式发光，安图、新产业、科美等逐渐占据头部地位。而迈瑞、迈克、亚辉龙等在此刻也嗅到了化学发光的商业机会，开始布局。到了2013年，国产化学发光才正式进入全自动转盘式即时检测时代，迈克、利德曼、安图率先推出这一形态产品，随后几年，迈瑞、亚辉龙等紧随脚步，带动国产发光进入对标进口、进口替代之路。国产产品竞争日渐激烈，但各有各的发展路径和竞争策略，后续另开文探讨。

纵观历史，化学发光免疫分析检测系统的发展主要围绕在固相载体和发光体系两大核心技术的不断发展和完善。

尽管上述这些标记免疫分析方法通过不断改进日趋成熟，但是，它们依然存在检测样品下限浓度不够低，灵敏度不高，很难定性定量地一次性检测同一个分析体系中产生的不同检测信号，而且微量化、自动化、高通量化程度都不高等缺点。目前免疫检测技术朝着多元免疫分析和超敏免疫分析两个方向发展。

下一篇我们来谈一谈免疫诊断技术发展的新趋势……

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