东成西就——一部多线程发展的临床免疫检验技术史（上篇）
2022-11-9 15:05|
编辑: 归去来兮|
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评论: 0|来源: 聚拓生物 | 作者 :郑喜
摘要: 为什么要去了解一个技术的历史呢？掌握最新技术不就所向披靡了吗？
也许有人会问，为什么要去了解一个技术的历史呢？掌握最新技术不就所向披靡了吗？很简单，任何一个技术的发展更迭从来都不是孤立的，都是在一脉相承的基础上做适当的创新而来的，甚至跨技术之间都可能是相互联系、彼此借鉴的。有言道，学史可以知兴替，明得失。在当下临床免疫学检测技术蓬勃发展的局面中，不免困惑不同技术平台之间的本质性差异以及在具体应用中的优劣性。万变不离其宗，让我们通过梳理整个免疫检测技术的发展历程，来了解各个技术基业长青抑或兴衰更替的背后原因以及意义。
首先，让我们把时钟拨回到20世纪中叶——经典免疫试验发展阶段在这里，不得不提经典的血清学检测——肥达氏反应。1896年，Widal利用伤寒病人的血清与伤寒杆菌发生特异性凝集的现象，有效地诊断伤寒病。
肥达氏反应：用已知的伤寒杆菌O、H抗原和甲、乙型副伤寒杆菌H抗原，与待测血清作试管或微孔板凝集实验,以测定血清中有无相应抗体存在，作为伤寒、副伤寒诊断的参考。
凝集反应是指细菌和红细胞等颗粒性抗原或表面包被抗原的颗粒性载体与相应抗体结合后，可出现肉眼可见的凝集现象。这是一个定性（或半定量）的检测方法，即根据凝集现象的出现与否判定结果阳性或阴性。凝集反应方法简便，敏感度高，因而在临床检验中被广泛应用：如用于菌种鉴定的肥达反应和布氏杆菌凝集试验、ABO血型鉴定等。
而基本在同个时期，另一经典免疫检测技术——沉淀反应也在逐渐发展并应用于临床。最早建立的沉淀反应是1902年时，Ascoli建立了环状沉淀试验；该试验主要用于鉴定微量抗原，如法医学中鉴定血迹，流行病学用于检查媒介昆虫体内的微量抗原等，因该技术敏感度低，且不能作两种以上抗原的分析鉴别，现已少用。
先将抗血清加入内径1.5～2mm小玻管中，约装1/3高度，再用细长滴管沿管壁叠加抗原溶液。因抗血清蛋白浓度高，比重较抗原大，所以两液交界处可形成清晰的界面。此处抗原抗体反应生成的沉淀在一定时间内不下沉。一般在室温放置10min至数小时，在两液交界处呈现白色环状沉淀则为阳性反应。
如果说环状沉淀反应是液体内沉淀反应的话，那接下来发展的是凝胶内沉淀反应。最常用的凝胶是琼脂糖。首先登场的是单向扩散试验：1946年，Oudin报道了试管法单向免疫扩散试验。
将血清或纯化抗体混入约50℃的0.7%琼脂糖溶液中，注入小口径试管内，待凝固后，在凝胶中加入抗原溶液，让抗原自由扩散入凝胶内，在抗原与抗体比例恰当位置形成沉淀环，在黑色背景斜射光处，极易观察到这种白色不透明沉淀带，沉淀环的数目和形态受抗原和抗体性质影响。溶液内含有多种抗原，在凝胶中含有各自的抗体，扩散后形成相应的抗原抗体复合物，出现多条区带。试管上部的沉淀带表示抗原量少或抗体量多；反之，下面的沉淀带则是抗原量大，抗体量少。 此后的1965年, Mancini又提出了平板单向免疫扩散试验。这种试验的出现使得以前只能进行定性测定的免疫试验进入到了定量的时代，并且其仍是目前较为常用的简易抗原定量方法，如免疫球蛋白、补体C3和C4等的测定（即医疗服务收费标准中的单扩法）
将制备的参考蛋白溶液，滴加在具有蛋白抗体的琼脂板上的样品孔内，让其自然扩散。在某个扩散区域处，抗原抗体达到最佳比率下，形成抗原抗体复合物沉淀，在实验琼脂板上出现了沉淀环。以沉淀环出现的直径，与参考蛋白溶液（具有确定蛋白量）的直径比较，确定样品内这个蛋白质的含量。
在单向扩散试验发展期间，为了限制抗原抗体向四周扩散，并加快移动速度，提高灵敏度，1953年时，Grabar和Williams在扩散的基础上加上了电泳，将区带电泳和免疫扩散有机地结合了起来，可很方便地用于纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异体液蛋白的识别。其后，又出现了对流免疫电泳、火箭免疫电泳、微量免疫电泳、免疫固定电泳(immunolixation electrophoresis，IFE)等。
经典免疫检验技术被全世界所有临床实验室普遍使用。但大家也注意到了，以上这些检验技术几乎是纯手工的，而且对试验结果的判断全靠肉眼。随着医学发展，实验室标本量迅速增长，需要进行检测的标本量很大，手工法无法满足；另一方面，在仪器制造领域，自动化技术和光学技术的发展，自动分析仪开始在实验室被采纳。国内是在20世纪60年代末引入了免疫沉淀试验技术，开创了我国抗原抗体检测的先河。固相到液相，由手工到自动化——免疫化学分析质的飞跃阶段根据抗原抗体能在液相中快速结合的原理，使用光学方法是否可以对血液蛋白质进行检测，开始被一些体外诊断厂商内的专家思考。1959年，利用抗原抗体复合物形成浊度改变，Schultze和Schwick等报道了透射比浊法应用于血浆蛋白分析，以吸光度值定量表示抗原抗体复合物的量；这种方法可以用光度计、比色计、生化分析仪来实现（这也解答了为何免疫比浊法是免疫原理，却被称为生化诊断的代表技术）。1967年，Ritchie等提出了用激光散射来测定补体C3和触珠蛋白形成的抗原抗体复合物，并称为散射比浊法；这种方法需要用到激光散射比浊仪，也就是目前全自动特定蛋白仪的前身。 直到1976年，Hyland和Behring公司推出散射比浊仪。在美国的Beckman也开始了免疫散射比浊的研究。
可溶性抗原与抗体形成的免疫复合物，经一定时间后聚合增加了液相浊度，导至液相透射光强度下降。免疫透射比浊法常用吸光度值表示，吸光度值与液相中免疫复合物含量呈正比。 而抗原抗体复合物形成的浊度，使入射光产生散射，散射光强度与免疫复合物数量成正比，这就是散射比浊法。
这项技术的出现，彻底地颠覆了原先的免疫检测技术，使免疫化学对血液蛋白检测得到的结果，在方法学上具有的精密度和可靠性完全展现出以往没有的水平。为了使临床化学分析仪适应微量蛋白的检测（<mg/L），同时解决免疫复合物大小的问题，催生了使用胶乳增强方法提高灵敏度的技术路线。如高敏C-反应蛋白（hs-CRP），灵敏度要求0.1-0.5mg/L，普通比浊法就达不到检测需求的技术参数。
胶乳增强免疫比浊法是后来出现的一种较为稳定、准确的免疫比浊衍生技术，其原理是将待测物质相对应的抗体包被在直径为10nm－1μm的胶乳颗粒上，使抗原抗体结合物的体积增大，光通过之后，透射光和散射光的强度变化更为显著，从而提高试验的敏感性。
图：拜定赛的Optilite和西门子的BNII免疫比浊仪，皆配备有乳胶增强试剂盒，广泛用于自身免疫病、肾病、多发性骨髓瘤等相关标志物的检测
目前基于生化分析仪的透射比浊法和基于特定蛋白分析仪散射比浊法已经被广泛应用于医院的临床检测中，根据国家药监局数据显示，注册证有效的体外诊断产品多达5000多项，主要包括甘油三脂、固醇类、肝功能、肾功能、血脂类、血糖类、无机离子类和特定蛋白类等的检测。
在未来免疫比浊分析仪的发展上，速率测定和乳胶增强技术是免疫比浊分析的发展方向。临床实验室需要可整合生化免疫于一体的全自动化一体机，与医院实验室信息管理系统一同构成安全的实验一体化解决方案。 标记免疫测定技术的问世使得血液中微量物质的精确定量成为可能
大家可以看到，前面所提到的免疫反应都是没有额外做标记的，即通过抗原和抗体本身形成的复合物来进行分析。在无标记免疫技术持续发展的同时，标记免疫技术也取得了一系列的技术突破，并逐渐成为了后来的主流检测技术。那下一篇我们来讲一讲当代标记免疫的发展历程。
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