立即注册找回密码

QQ登录

只需一步,快速开始

微信登录

微信扫一扫,快速登录

手机动态码快速登录

手机号快速注册登录

搜索
小桔灯网 门户 资讯中心 院所动态 查看内容

Journal of Infection | 邵逸夫医院、浙大一院研究证实:基于内标定量的mNGS可提升疑 ...

2021-10-19 10:23| 编辑: 归去来兮| 查看: 4456| 评论: 0|来源: 小桔灯网

摘要: 近日浙江大学医学院附属邵逸夫医院、浙江大学医学院附属第一医院等15家医院联合杰毅生物发表了题为“Metagenomic sequencing with spiked-in internal control to monitor cellularity and diagnosis of pneumonia” ...


    近日

浙江大学医学院附属邵逸夫医院、浙江大学医学院附属第一医院等15家医院联合杰毅生物发表了题为“Metagenomic sequencing with spiked-in internal control to monitor cellularity and diagnosis of pneumonia”的文章。该研究结果显示,mNGS检测到的微生物序列数受标本中微生物和人源细胞含量双重影响,而差异化裂解去人源会同时造成某些微生物序列数上升,某些微生物序列数下降,因此不建议对所有标本无差别应用。借助分子内标(spike),mNGS可实现对标本中人源和病原含量进行定量检测,结合选择性去人源,对BALF的诊断阳性率可达93.04%,对BALF的诊断特异性可达93.33%。

这一研究成果正式发表于《Journal of Infection》(2020年影响因子6.072),论文第一作者为浙江大学附属第一医院呼吸内科周华主任和杰毅生物研发部欧阳川博士,通讯作者为浙江大学医学院附属邵逸夫医院副院长、感染科主任俞云松教授和杰毅生物医学部负责人刘超博士。

研究背景

病原宏基因组检测(mNGS)是基于下一代测序技术(NGS)对标本中的核酸进行无差别的高通量测序,再与微生物基因序列数据库比对分析,实现了非靶向的泛病原体检测,具有灵敏度高、检测周期短、不依赖培养等优点。但由于其无偏倚测序的特性,mNGS获得的信息中包括标本中的病原体和大量的人源宿主,进而影响了病原体的检测敏感性。尽管去人源/去宿主技术可在一定程度上提高mNGS的敏感性,但同样存在非特异性损失病原体的风险。

图1. 微生物序列数(PCR建库、PCR-free建库)与标本中人源细胞数量成反比


本研究收集了浙江省15家医院205名疑似肺炎且排除RNA病毒感染的患者入组,每位患者取肺泡灌洗液后分成两份进行检测(一份去人源,一份不去人源)。


主要研究结果

➢ mNGS通过分子内标获得H index,可对标本中人源细胞进行定量

研究者设计并测试了5种不同长度和核苷酸序列(与任何已知生物的基因组无显著同源性)作为内标分子(spike -in internal control,简称spike),用来监测标本中人源与微生物核酸的载量。模拟实验显示,spike序列数与投入量呈正相关,但与人源细胞数呈负相关。

图2. spike RPM随标本中人源细胞数量的增加而降低


研究者在每个BALF标本中加入等量的spike 1,继而进行mNGS测序,并同时采用AO/PI双荧光染色法进行有核细胞计数,以评估spike 序列数与有核细胞计数之间的关联。结果显示, spike序列数与细胞计数呈负相关,人源指数(H index)与细胞计数呈正相关,人源指数(H index)可以有效反应标本中人源核酸的含量。

图3. Spike序列数,人源指数(H index)与有核细胞计数的相关性分析


➢ 去人源是双刃剑,不建议对所有标本无差别应用

考虑到人源含量影响mNGS检测敏感性,研究者对常规mNGS(不去人源)和去人源后mNGS检测(差异化裂解)进行对比。结果显示,差异化裂解去人源会同时造成某些微生物序列数上升,某些微生物序列数下降,对细菌和分枝杆菌的富集作用较病毒和真菌更明显。94.79%的标本去人源前后的结果一致,但8例(8/205, 3.90%)标本在常规mNGS检测时结果为阴性,而在去人源后mNGS检测结果为阳性,其中包括4例结核分枝杆菌、2例烟曲霉和2例白色念珠菌。去人源后造成损失的病原体主要为耶氏肺孢子菌(2例,RPM分别下降7695.87和8397.47)。

图4. 入组标本的人源指数以及去人源对

微生物序列数的影响


➢ 基于分子内标和选择性去人源的mNGS提升疑似肺炎患者诊断率

研究者对mNGS用于感染/非感染性疾病的诊断性能进行了分析,205例患者中有15例(7.32%)为非感染性疾病,190例为感染性疾病,其中115例(60.53%)发现了明确病原学依据。在115例患者中,mNGS的阳性率为93.04%(107/115),显著高于临床常规检测(细菌、真菌培养,G/GM/GXM试验,抗酸染色,Xpert等)的阳性率49.57%(57/115)。mNGS共为123例患者做出(60.00%)明确诊断,其中64例患者,mNGS结果为唯一诊断依据,显著多于常规检测(8例)。另外,研究发现mNGS阴性结果也有助于临床排除感染,本研究通过mNGS明确非感染诊断14例(93.3%),包括间质性肺炎6例、肺癌4例、心脏衰竭1例、过敏性肺炎1例、慢阻肺(COPD)1例和放射性肺炎1例。

图5. 入组患者检测结果及临床诊断结果


总结

mNGS因其无偏倚、非靶向的特性,在鉴定疑难、危重、特殊感染方面相较常规病原学检测方法具有显著优势,但标本中人源含量会影响mNGS对于病原体的检测敏感性,而差异化裂解技术在提升微生物检测性能的同时,也会造成一些微生物序列的减少、甚至丢失,因此需要仔细评估和谨慎执行,不建议对所有标本无差别使用。


Q-mNGS原理解析

mNGS对于病原体的检测敏感性受标本中人源核酸含量影响,在相同测序数据量下,标本中人源核酸含量越高,mNGS检测到的人源序列就越多,即检测到的病原体序列就越少,对于病原体的检测敏感性就越差,甚至会导至漏检或假阴性。

Q-mNGS在对标本进行检测前,在每份标本中加入等量的spike,并与标本中其他核酸(人源核酸、病原体核酸)一起进行检测,因此以spike序列信息作为参照,将人源和病原体核酸进行相对定量,获得标本中真实的人源核酸和病原体核酸含量,以识别高人源下的假阴性和低人源下的真阴性,选择性的对高人源标本进行去人源,提升检测阳性率,同时降低去人源造成的病原体损失,还可以协助临床进行病原体的载量监控和病程管理。

图6. Q-mNGS通过spike定量人源和病原体核酸


参考文献

1. Peng JM, Du B, Qin HY, Wang Q, Shi Y. Metagenomic next-generation sequencing for the diagnosis of suspected pneumoni in immunocompromised patients. J Infect 2021;82(4):22–7 AprPubMed PMID: 33609588.

2. Schlaberg R, Chiu CY, Miller S, Procop GW, Weinstock GProfessional practice C Validation of metagenomic next-generation sequencing tests for universal pathogen detection. Arch Pathol Lab Med 2017;141(6):776–86 JunPubMed PMID:28169558.

3. Charalampous T, Kay GL, Richardson H, Aydin A, Baldan R, Jeanes C,et al. Nanopore metagenomics enables rapid clinical diagnosis of bacterial

lower respiratory infection. Nat Biotechnol 2019;37(7):783–92 JulPubMed PMID:31235920.

4. Luan Y, Hu H, Liu C, Chen B, Liu X, Xu Y, et al. A proof-of-concept study of an automated solution for clinical metagenomic next-generation sequencing. J Appl Microbiol 2021;131(2):1007–16 Jan 13PubMed PMID: 33440055.

5. Gu W, Deng X, Lee M, Sucu YD, Arevalo S, Stryke D, et al. Rapid pathogen detection by metagenomic next-generation sequencing of i


声明:
1、凡本网注明“来源:小桔灯网”的所有作品,均为本网合法拥有版权或有权使用的作品,转载需联系授权。
2、凡本网注明“来源:XXX(非小桔灯网)”的作品,均转载自其它媒体,转载目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责。其版权归原作者所有,如有侵权请联系删除。
3、所有再转载者需自行获得原作者授权并注明来源。

鲜花

握手

雷人

路过

鸡蛋

最新评论

关闭

官方推荐 上一条 /3 下一条

客服中心 搜索 官方QQ群 洽谈合作
返回顶部