IVD质量管理系列の技术篇 免疫学知识（上）

一、 概述：

体外诊断试剂中免疫诊断试剂的市场份额占据三分之一，包括免疫比浊、酶联免疫法、化学发光免疫分析、胶体金免疫层析、荧光免疫分析、放射性核素免疫分析等均基于抗原与抗体的免疫反应机理而衍生得来，本章节主要是介绍免疫反应中重要的两个物质：抗原、抗体的分子结构及其反应机理。帮助大家建立和掌握免疫分析方法的基本概念。

二、 抗原属性及其分类： 

2.1 抗原：是指能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗原进入机体后，可刺激机体B淋巴细胞转化成浆细胞，由其产生抗体和引起细胞免疫。在免疫测定中，抗原是指能与抗体结合的物质。能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于5kd的蛋白质，例如乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、甲胎蛋白（AFP）等。抗原的反应性取决于抗原决定簇（antigenic determinant），或称为表位（epitope）。一个抗原分子可带有不同的决定簇，同一抗原决定簇可以有1个位点以上的分布。

2.2 抗原的的属性：抗原具有免疫原性和免疫反应性。免疫原性是指引起免疫应答的性能。它可以用特异性抗体的形成和（或）特异免疫效应淋巴细胞的产生来衡量。它反映了动物机体的反应性能，如乙型肝炎疫苗接种后可以诱导机体产生保护性抗体，卡介苗可以让淋巴细胞产生记忆，再次接触结核杆菌后激发淋巴细胞的免疫反应。免疫反应性是指能与免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）在体内外相互作用起反应的性能。免疫反应性又称为抗原特异性或抗原专一性。

因此，抗原也可以定义为是一类能够刺激机体的免疫系统，诱导发生免疫应答，产生体液免疫的抗体和（或）细胞免疫的淋巴细胞，并在体内外与之反应的物质。

2.3 半抗原及其载体效应：

小分子化合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体产生特异性抗体的，称为半抗原（hapten），例如某些激素、药物、多肽、寡核苷酸等。因此，半抗原具备了免疫反应性，但不具备免疫原性。要想让半抗原具备免疫原性，必须与载体蛋白进行偶联，而且载体蛋白本身必须是具备免疫原性。

2.4 抗原分类：

2.4.1 根据抗原颗粒大小及可溶性分：

颗粒抗原：细菌、支原体、衣原体、病毒、红细胞等，它们相对颗粒较大，当与抗体结合时，可出现凝集现象，即凝集反应。

可溶性抗原：蛋白质、多糖、结合蛋白（糖蛋白、脂蛋白、核蛋白），颗粒较大。在水溶液中形成胶体溶液，与相应抗体结合后形成可见沉淀。

2.4.2 根据抗原来源及其制备方法分：

天然抗原：指自然界存在的蛋白质、多糖和结合蛋白，通过富集、培养、提取、纯化等必要的过程制备成所需的抗原。

基因工程抗原：过DNA重组技术，在体外培养并表达出需要的目的抗原。

合成抗原：利用多肽合成技术，人工合成的多肽类抗原，分子量较小，一般来说从几十个氨基酸到上百个氨基酸序列大小。

上述有关于不同抗原的制备的方法，有兴趣的读者可以参考专业文献。针对抗原作为诊断试剂原料，在质量控制方面还需要进行深入研究。

2.4.3 从抗原性能来分：

完全抗原：具有免疫原性和免疫反应性

半抗原：具有免疫反应性，只有与载体蛋白偶联形成完全抗原才具备免疫原性，产生的抗体包括抗半抗原抗体和抗载体蛋白抗体

三、抗体属性及其分类：
3.1 抗体结构：是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(Ig)。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。Ig由两个轻链（L）和两个重链（H）的单体组成，是唯一能通过胎盘的抗体。Ig的轻链是相同的，有κ（kappa）和λ（Lambda）两种型别。五类Ig的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。IgG和IgM的重链分别称为γ（gamma）链和μ（mu）链。IgG的结构见图：

3.2 Ig的五种类别：

IgG：IgG分子量约为150kd，经还原型SDS-PAGE电泳，可得约50kd和25kd大小的两条片段。可被木瓜蛋白酶分解为三个区段，其中两个相同的区段称抗原结合片段（Fab）。每个Fab都保存结合抗原的能力，但只有一个抗原结合位点，是单价的，与抗原结合后不出现凝集或沉淀。另一区段称Fc段，无抗体活性，但具有IgG特有的抗原性。IgG的另一个特性是能够与金黄色葡萄球菌中提取的A蛋白（SPA）反应，其中结合位点也是FC段。

IgG可被胃蛋白酶分解为两个片段，一个Fab双体，称F（ab'）2，能和两个相同的抗原结合；另一片段类似Fc，随后被分解成小分子多肽，无生物活性。

这里至少提供3点信息：与抗原结合是2个Fab片段呈二价、FC段的免疫原性，使得二抗（抗IgG的抗体）的获得就不难理解。IgG抗体纯化工艺中的SPA亲和柱的运用，得到了解释。

   IgM：IgM是由五个单体组成的五聚体，含10个重链和10个轻链，具有10个抗原结合价，由于空间位置的影响（空间位阻），只表现为五个抗原结合价。IgM分子量约为900kd，经还原型SDS-PAGE电泳，可得约50kd和25kd大小的两条片段。IgM不能通过血管壁，几乎全在血液中，也不能通过胎盘。这里有意思的，人类ABO血型的天然抗体是IgM，这就可以解释为何胎儿与母亲血型不同也不会造成溶血症。当然，母亲的IgG抗体可以通过胎盘而对胎儿进行保护。

机体被微生物感染后，先产生IgM抗体，然后产生IgG抗体。因此，IgM常规用于急性期感染的指标。经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少而消失，而IgG抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年之久。

IgA：IgA在血清中的含量较少，约占血清Ig总量的15%左右。在全身的分泌液中，如泪液、唾液、初乳、奶液以及呼吸道、胃肠道、生殖道、泌尿道等体液中都含有大量的二聚体IgA，在这些易感染的部位产生有效的免疫保护作用。

这就不难理解市场上的唾液、尿液检测的免疫诊断试剂，如检测唾液或尿液中的HIV抗体试剂盒。

IgA能有效的凝集细菌和中和毒素。母乳喂养的婴儿比人工喂养的更少出现腹泻性感染，这是由于母乳中存在大量的IgA抗体对肠道细菌的预防功能。

IgE：由鼻咽、支气管、扁桃体、胃肠黏膜固有层的浆细胞产生，介导I型变态反应的抗体。I型变态反应是已经获得免疫的机体，再次接收同样的抗原或过敏原刺激所产生的反应，反应时迅速、强烈、消退快但严重的在数秒至几分钟内引起呼吸困难、休克甚至死亡。因此，筛查过敏原避免再次接触和抗过敏药物治疗是预防此类过敏反应的有效手段。

IgD：有关于IgD的研究较少，目前生理功能不够明确。

3.3 抗体的产生：

机体受抗原刺激后，B淋巴细胞分化成浆细胞产生相应的抗体。抗体产生的途径、以及再次接触免疫原后抗体的应答，可以用下面两个图解释：

根据抗体产生的特点，IgM可以作为急性感染期的指标，IgG视为既往感染或恢复期的标志物。另一方面，可以根据前后两份血清样本中IgG滴度的升高（如1：4甚至更高）来判定现症感染。

每一系B细胞只产生针对某一抗原决定簇的抗体。如将多种抗原或含有多个抗原决定簇的抗原注入机体，则将由多系的B细胞产生相应的多种抗体（多克隆抗体），这些抗体均存在于免疫血清中。免疫测定中所用的多克隆抗体一般用抗原免疫兔、羊或马制得。

产生抗体的B细胞可在体外与繁殖力强的肿瘤细胞融合成杂交瘤细胞。将单个杂交瘤细胞分离，在体内或体外培养而分泌的单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb或Mab）。单克隆抗体仅针对一种抗原决定簇，具有很高的特异性。单克隆抗体通常用抗原免疫小鼠制备。将免疫的脾细胞（含产生抗体的B细胞）与小鼠肿瘤细胞融合，分离杂交瘤细胞，接种于小鼠腹腔，产生的腹水中含有浓度很高的单克隆抗体。

上述有关于多克隆抗体制备、单克隆抗体制备的方法，有兴趣的读者可以参考专业文献。针对抗体作为诊断试剂原料，在质量控制方面也需要进一步研究。

四、有关术语解释：

潜伏期：是指病原体侵入机体到最初出现症状和体征之间的这段时期。各种疾病的潜伏期长短不一，短者数小时，长者可达数月或数年。一般认为潜伏期长短与感染病毒的种类或者型别、病毒的致病性、病毒的数量、感染途径、被感染机体的免疫力以及其他非生理因素等有关。比如艾滋病病毒，经输血感染的剂量一般较大，所以潜伏期相对较短，而性接触感染艾滋病病毒的剂量较小，因此潜伏期相对较长。HBV感染后的潜伏期一般为20天至6个月，平均70－80天；HCV感染后临床表现一般较轻，常为亚临床型，但输血后感染的潜伏期一般为20天到6个月，平均8周；HIV感染后1到2个月内可能出现急性的症状和体征，随后进入较长期的无症状期，持续6－15年，平均8－10年，大量输血的可缩短至1－5年。梅毒的潜伏期一般为2－4周。

窗口期：指的是受病原体感染后出现在血液中直到可以检出足够多的相应病毒标志物（抗原或抗体）前的时期。在这段时间内，血清中无相应的抗原抗体标志物。各种病原体的窗口期是不一样的，一般所称的窗口期指的是检测到病原体抗体的时间，但抗原以及核酸检测同样存在窗口期，但时间大大缩短。HBV、HCV、HIV抗体的窗口期的时间分别为56、70和22天，P24抗原的窗口期平均为15天，而应用核酸技术，可分别将HBV、HCV、HIV的窗口期缩短为41、12、11天。随着检测的病原体标志物的不同，检测技术的提高，试剂的更新换代，灵敏度的提高，可大大缩短窗口期时间。

免疫损伤：对自身组织、细胞或蛋白质产生的免疫应答状态，称为自身免疫。由自身免疫造成的对自身组织的损伤和临床症状的称为自身免疫疾病（AID）。如常见的系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎。目前针对自身免疫性疾病的诊断也是非常大的一块市场。

免疫耐受：对外来异物（抗原）不产生免疫应答的现象，称为免疫耐受。比如某些人对乙型肝炎疫苗耐受，不产生HBsAb保护性抗体。

参考文献：《分子免疫学基础》，王重庆编著，北京大学出版社。