作者：上海市第一人民医院检验科 李莉教授  恶性肿瘤远处转移是临床上实体恶性肿瘤治疗失败或复发的主要原因之一。而循环肿瘤细胞的存在正是实体恶性肿瘤远处转移的根源。肿瘤远处转移的最经典依据是1889年Paget[1]提出的“种子和土壤”学说，该学说认为肿瘤转移的发生和发展，是处于活跃或活化状态的肿瘤细胞作为“种子”，当遇到适合的器官、组织的基质环境，即“土壤”时，就会在此定居、生长即发生肿瘤的转移，从而部分解释了肿瘤原发灶与转移灶之间的关系。但原发部位的肿瘤（种子）是如何到达远处器官或组织（土壤）的这一问题一直困扰着人们。直到1869年，托马斯•阿什沃思（Thomas Ashworth）[2]在1例转移性癌症患者血液中观察到了外周血循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）—从实体瘤中脱离出来并进入血液循环的肿瘤细胞。他推测，这些细胞在癌症转移过程中发挥了非常重要的作用，并可能提供疾病进展的相关信息，CTCs的概念初步形成。据统计，90%以上的肿瘤病人死于肿瘤的转移和复发，实体肿瘤或转移灶的肿瘤细胞在特定条件下，通过上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），从形态上发生向间充质细胞表型的转变并获得迁移的能力。间充质细胞与上皮细胞相邻，只是其结构松散，缺乏细胞连接（cell adhesion）和细胞极性，并且具有转移和侵袭能力。因此，脱落的CTCs得以进入外周血液循环，这是肿瘤发生转移的必要前提。脱离原发灶入血的CTCs至少面临着血流剪应力、失巢凋亡、免疫细胞识别杀伤等三重致命考验，进入循环的大部分肿瘤细胞都会失去活性，只有不足0.01%可到达远端器官，通过迁移、粘附、相互聚集形成微小癌栓，并在适合的微环境条件下，CTCs又发生间质-上皮转化（mesenchymal-epithelial transition，MET），生成新的肿瘤，从而导至肿瘤转移的发生。 从提出CTCs概念近一个多世纪的时间里，由于初期实验条件、技术的限制以及学者对CTCs的认识的局限性，CTCs检测及临床应用进展不大。直至上世纪末尤其是本世纪初，随着分子生物学、计算机技术的发展，免疫标记技术以及分子生物学技术的突飞猛进，CTCs分离及分析鉴定技术得以迅速发展，CTCs检测和临床应用取得了重大进步，为早期发现肿瘤的复发转移、评估手术、放疗、化学等疗效、判断预后、确定肿瘤分子特征、选择合适的个体化治疗等方面提供了重要的实验室依据。目前，学者所共识的循环肿瘤细胞的概念是：自发或受外界因素作用（如诊疗操作等）由原发灶或转移灶进入外周血循环的肿瘤细胞。肿瘤细胞的脱落、侵袭并进入血液循环是肿瘤转移的最初阶段，并为最终形成肿瘤转移灶提供了可能。进入循环系统的肿瘤细胞大部分在机体免疫识别及杀伤等作用下发生凋亡，有极少数肿瘤细胞在循环系统中存活下来，在一定条件下，进入血液循环而未被清除的肿瘤细胞通过迁移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展为转移灶[3]。本文拟就CTCs分离技术、分析鉴定技术、临床应用、CTCs主要分析仪器作一介绍。 1 循环肿瘤细胞分离富集技术 越来越多的分子生物学和临床研究结果表明，肿瘤转移很可能在肿瘤发生的早期就已经出现，在外周血中检到CTCs是预示肿瘤转移最直接、重要的方法，在肿瘤早期转移的临床诊断、预后判断、监测疗效等方面具有重要意义。CTCs的发现有望改变临床上仍依赖于影像学检查及传统肿瘤标志物的现状。由于外周血中的CTCs含量极为稀少，一般认为在外周血中大约105~107个单核细胞中才有一个CTCs[4]，因此，对CTCs检测技术的灵敏度和特异性提出了极高的要求。目前各种CTCs的检测系统主要包括CTCs分离和富集系统以及CTCs的检测和鉴定系统。而分离和富集系统对检测外周血的CTCs是非常必要的。理想的CTCs分离与富集及检测技术应能达到以下六点要求：（1）高捕获率或高灵敏度，就是可以将样品中的CTCs尽可能多的分离出来，即至少能够在上亿个血循环细胞中发现一个肿瘤细胞；（2）高特异性，要求检测结果准确无误，尽可能降低假阳性或假阴性，目标是分离出来的细胞只有CTCs，其它细胞的含量很少或没有；（3）要求CTCs不能被污染，收集到的CTCs可以进行表型和基因型分析；（4）高通量，即能在短时间内处理大量样品；（5）重复性，回收率高。（6）尽可能降低成本[5、6]。目前用于临床实验研究的CTCs分离和富集技术非常之多，一般来讲根据其物理性质和基于亲和性与识别的生物性质以及两者综合利用可分成3类。但目前来说仍没有理想的方法，每种单独的方法都有自己的优势和缺点。虽然两种或三种方法的结合有可能成为较为理想的方法，但近十几年的研究进展不大。 1.1 密度梯度离心法（Density Gradient Centrifugation，DGC） 密度梯度离心的原理是基于血液中各种正常细胞与CTCs密度的差别，利用其在密度梯度介质（如Ficoll-Paque介质、OnceQuick系统）中的沉降系数不同，将细胞悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力的作用，用分离液将CTCs与其它细胞层分离。离心后在细胞分离液中各种细胞呈现梯度分布，依次为：血浆成分、单个核细胞（淋巴细胞、单核细胞、肿瘤细胞等）、分离液、中性粒细胞和最下层的红细胞，从而获取目标细胞。有报道用OnceQuick系统分离肿瘤细胞得到了632倍的富集效果，标明该系统对CTCs的平均回收率高、富集效果好，而采用Ficoll-Paque介质只有3.8倍。DGC方法操作简便、成本低，但该分离方法一般要求血量较大，且灵敏度和特异性均较低，且在操作过程中可能会损失CTCs。 1.2 细胞过滤技术（Isolation by Size of Epithelial Tumor Cells，ISET） ISET方法的原理是基于细胞大小不同和机械性能的差别。一般认为，肿瘤细胞的直径为15~30μm，大于绝大多数血细胞的直径（如红细胞5~9μm），根据细胞大小所设计的滤过膜滤过血液样本后将直径大的肿瘤细胞分离出来。但由于目前还没有报道证实所有肿瘤细胞直径都大于8μm，使其分离敏感性受到质疑。该方法对技术、设备要求不高，但会丢失一小部分直径小于滤膜孔径的CTCs，导至检测灵敏性降低。 1.3 细胞粘附技术（Cell adhesion techniques，CAT） 细胞粘附分离技术是CTCs捕获的一项基本技术，利用的是亲和反应原理，即利用CTCs与生物生化修饰或物理修饰捕获表面的亲和作用，含有CTCs的样本经过捕获表面时，CTCs则被吸附在捕获表面，随后冲洗掉未被粘附的非目的细胞，从而得到CTCs。此后发展起的多种纳米及微流控技术都采用了这一基本技术。 1.4 免疫磁珠分离技术（Immunomagnetic separation，IMS） 与普通血细胞相比，CTCs具有某些特殊的生物标志物，包括CTCs表面的上皮细胞粘附分子（Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）、细胞角蛋白（Cytokeratin，CK）以及肿瘤特异性抗原，而血液中几乎所有的细胞都是反磁性或弱磁性的，利用肿瘤细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单克隆抗体相结合，继而在外加磁场中通过相应抗原抗体复合物与磁珠吸附而滞留在磁场中或定向移动到指定区域，没有表面抗原的其它细胞由于不能与连接磁珠的特异性单克隆抗体结合而不能在磁场中停留，从而使肿瘤细胞得以从血液中分离出来[7]。该方法的敏感性一定程度上受到CTCs表面抗原表达的制约。例如：采用EpCAM抗体捕获CTCs，由于EpCAM在CTCs的表达率一般为60-70%，往往会丢失部分CTCs；单一的CK抗体也不能完全识别癌细胞表达的所有CKs；在CTCs上皮间质化过程中，一些基于标准化上皮标志物的筛选抗体无法检测出所有CTCs等等。这一切都受到目标抗原的表达量与特异性以及与相应抗体的结合能力影响。 1.5 纳米基质分离技术（Nanoimprint matrix isolation technology） 纳米技术在纳米尺度对检测物质进行检测和操作，是一门融合化学、生物学、物理学和药学的交叉学科。通过在基底表面制备纳米结构设计细胞界面，并修饰相应的特异性识别分子，可以将血液中的CTCs捕获并分离出来。陆宁宁等[8]综述了据此思路研发的技术设备有：（1）纳米柱、纳米线及纳米纤维：在CTCs捕获装置中，纳米柱、纳米线及纳米纤维基质均可通过多种方式获得。如利用湿法刻蚀或化学气相沉积法可制备纳米柱或纳米线基质；（2）纳米粗糙表面：由于CTCs的黏附性较血液中其它细胞强，所以粗糙界面的构建为CTCs高效分离提供了另外一种选择；（3）碳纳米材料：以碳纳米管、石墨烯为代表的碳纳米材料因具有高比表面积、优良的导电性能和良好的生物相容性等特点，成为了生物传感器、储能材料、药物载体以及高分子等领域中的常用材料；（4）仿生材料：自然粒子如哺乳动物细胞和花粉，因具有独特的拓扑结构而呈现众多优良性能。以这些复杂结构的自然粒子为模板，可制备具有相应结构的仿生材料。相对于传统的CTCs分离法的分类效率及特异性有了极大的提高，并且制备简单，不需要复杂昂贵的微加工设备。 1.6 微流控芯片技术（Microfluidic chip technology） 微流控芯片技术（Microfluidics）是把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上， 自动完成分析全过程。微流控技术可在微米结构中操控纳升至皮升体积液流，是近年来迅速崛起的集生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。基于微流控芯片的CTCs分离技术通过在芯片通道内部修饰可识别的细胞表面抗原的抗体或核酸适配体，当通入含CTCs的样本时，CTCs与通道表面捕获试剂结合，实现特异性分离。该方法所需样品量小，无需对血液样品进行前处理，且流动的流体环境有利于去除非特异性吸附的其它细胞，从而提高分离纯度。Dharmasiri等[9]采用包被了EpCAM抗体和抗-PSMA核酸适配体的芯片从血液样本中分离了不同的CTCs，其捕获率大于90%，纯度达到100%，如将芯片通道中的平的捕获表面用抗体修饰的纳米结构表面替代，CTCs捕获率甚至可以提高到95%。微流控芯片是一个集样品制备、反应、分离、检测等功能于一体的小型分析实验平台。最早用于制作微流控芯片的材料主要是石英、玻璃及单晶硅片，随着技术的进步，一系列有机聚合物如聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）、聚甲基丙烯酸甲酯（PolymethylMethacrylate，PMMA）、聚碳酸酯（Polycarbonate，PC）等材料已发展成为芯片制作的常用材料。目前根据微流控技术使用的原材料可分为基于硅材料的微流控芯片、基于PDMS/玻璃的微流控芯片、基于热聚膜的微流控技术（如PMMA）、基于微流控芯片平台的磁分离技术、基于微流控芯片平台的微纳米基质分离技术等[7]。 除微流控芯片技术外，微流控技术（Microfluidics）还在其它循环肿瘤细胞分选富集方法中，取得了迅速发展。在微流控器件中从血液样品注入到循环肿瘤细胞分选可以实现连续的过程，极大地简化了操作程序，并可减少目标细胞的损失。黄笛等根据作用方式将微流控分选富集技术分为被动分选和主动分选两大类：被动分选技术包括微结构过滤、场流及水力分选、确定性侧向偏移、惯性分选、仿生分选、亲和性分选等方法，一般具有通量高、不需要额外施加作用立场的优点；主动分选技术包括介电泳分选、磁分选、声分选、光分选等方法，一般具有分选精度高的优点[10]。 2 循环肿瘤细胞检测技术 经过上述方法分选富集的CTCs需要进一步分析鉴定，选用特异性的检测技术或方法对CTCs及其分子进行确认是循环肿瘤细胞检测的重要步骤。常用的鉴定检测技术包括免疫细胞化学技术（Immunocytochemistry，ICC）、逆转录聚合酶链反应（RTPCR）、荧光原位杂交技术（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）和流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）等。 2.1 免疫细胞化学技术（Immunocytochemistry，ICC） 是以显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和细胞化学呈色反应，对相应抗原进行定位、定性和定量的技术。目前选择的循环肿瘤细胞的相关抗原包括EpCAM、上皮角质蛋白（CKs）、上皮细胞膜特异性抗原、肿瘤相关糖蛋白（TAG）或特异性标志物（如HER2、抗乳球蛋白等）。其优点在于肿瘤细胞膜未被破坏，可以进行后续研究，但此法敏感性低、检测繁琐、易误诊。近年来研发出的光纤阵列扫描仪（Fiber scanning technology，FAST）、激光扫描细胞计量仪（Laserscanning cytometry，LSC）、自动细胞显像系统(antomated cellular imaging system，ACIS)等，使检测系统有了很好的协同性，能完成高速扫描、准确定位免疫荧光标记的肿瘤细胞，有效提高了扫描荧光染色细胞的有效率和敏感性[11]。虽然如此，肿瘤细胞表面抗原表达的不均一性，在一定程度上降低了检测的敏感性。 2.2 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR） 反转录聚合酶链反应检测CTCs是基于组织或肿瘤特异性mRNA的表达或某些基因改变后DNA水平的异常, 这些mRNA不表达于正常外周血细胞，所以在外周血中检测到特异mRNA可以间接提示CTCs的存在。RT-PCR检测CTCs是在PCR基础上扩增由肿瘤特异性mRNA序列逆转录的DNA片段，从而识别组织或肿瘤特异性mRNA的表达或某些基因改变后RNA水平的异常。这些mRNA几乎不表达于正常外周血细胞，所以在外周血中检测到特异mRNA可以间接提示CTCs的存在。目前，RT-PCR的灵敏度已经很高，在晚期癌症患者的外周血中，RT-PCR技术可以从每毫升血液中检测到单个肿瘤细胞。Wang等在乳腺癌中利用以KRT19和ERBB2作为目的基因进行双相RT-PCR检测发现，双相RT—PCR检测循环肿瘤细胞的敏感性比免疫细胞化学技术检测要高，而且特别在早期乳腺癌尤为明显[12]。但是，由于mRNA的不稳定性、取样时上皮细胞的污染、肿瘤标志物在外周血的非正常表达以及假基因干扰等因素的影响，可致假阳性。同时该方法无法进行形态学观察以及肿瘤细胞的定量限制了该技术的应用。 2.3 流式细胞术（Flow cytometry，FCM） 是一项集激光、电子物理学、计算机、流体动力学、细胞免疫学等方法为一体的细胞分析技术。它利用肿瘤细胞单抗结合荧光物质使肿瘤细胞染色，然后用流式细胞仪分析，染色细胞被视为阳性，大致敏感性为1/105。此技术可以对外周血样本的CTCs进行精确定量技术，并可以检测细胞DNA含量。近来高通量FCM（如Fishman-R microfluidic FCM）以及新肿瘤标志物（如EGFR、磷酸化EGFR）的应用大大提高了流式细胞术的诊断效率[13]。 2.4 CTCs芯片技术（CTCs-Chip） CTCs芯片系统富集得到的CTCs采用相同的分析方法，由于CTCs并不表达白细胞的共同抗原CD45，该检测系统采用不同荧光标记的抗EpCAM抗体、抗EGFR抗体、抗细胞角蛋白CK-8、CK-18和CK-19抗体以及核荧光染料DAPI作为阳性指标，CD45作为阴性指标。可在10亿以上血细胞检测出单个癌细胞，敏感性非常高，并适用于所有类型肿瘤患者的外周血样本。该方法大大提高了敏感性和从全血中捕获稀少细胞的得率, 同时操作过程简单温和，从而使分离到的CTCs保持活力。目前第二代CTCs-Chip技术（Hchipherrin one—chip），不仅改进了该芯片构造，使血液标本流经芯片时形成微漩涡，增加了芯片表面包被抗体捕获CTCs的机会，更加有效捕获数量极少的CTCs，可捕获血液中90%以上的癌细胞，而且该芯片还安装了一个标准载玻片，可使用传统病理检查方法鉴别癌细胞[14]。 3 循环肿瘤细胞检测的临床应用 循环肿瘤细胞在原发肿瘤早期就可以发生并可以在外周血中检测到，已经开始用于肿瘤的辅助诊断。近年来，CTC检测在临床上的应用使之成为了国际肿瘤分期系统的标准之一。2007年美国临床肿瘤协会（ASCO）首次将CTC纳入肿瘤检测标志物[15]。CTCs作为一种全新的肿瘤生物标志物，在疾病早期阶段有助于良、恶性肿瘤的鉴别诊断、肿瘤早期诊断、辅助诊断与肿瘤分期、判断患者预后，治疗过程中可用以进行疗效监测以及指导个体化治疗。但必须认识到：自2004年美国强生公司Veridex开发的Cellsearch CTC检测技术获得美国FDA认证（准入应用于预测有转移性的乳腺癌、结直肠癌或前列腺癌的无进展存活率和总存活率）以来，其它众多厂家推出的循环肿瘤细胞检测仪器都未获得相关认证或准入，对恶性肿瘤的应用领域也未在更广的肿瘤类型中获得准入。目前，更多的报道尚处于临床研究阶段。但是，CellSearch CTC检测系统2015年底已告停产的传闻也从侧面反映了为“肿瘤患者的科学算命”中“算命”的份量更重一些。 乳腺癌是我国女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率逐年上升，远处转移是主要的致死因素。CTCs的检测对乳腺癌预后判断、监测病情和早期发现微转移等具有重要临床意义。Biggers等检测了41例早期乳腺癌患者，其中10例（24.4%）在术前已可检测到CTCs。研究表明，转移性乳腺癌患者在治疗前、治疗中和治疗后的CTCs水平均与其预后密切相关，CTCs可作为转移性乳腺癌患者独立的预后因子。有研究报道采用黏蛋白1（mucin 1，MUC1）和CK19共同作为检测乳腺癌CTCs的标志物，用EPISPOT检测转移性乳腺癌（metastatic breast cancer，MBC）患者中CTCs分泌的MUC1，结果发现所有被检者的结果均为阳性，而健康人群中却无法检测得到。龚福生等的研究显示，62例乳腺癌患者CTCs的阳性率与TNM分期、Ki-67和HER-2表达与否显著相关，而与月经状态、ER和PR表达与否无关[16]。本研究在I期患者中有1例检出CTCs（16.7%），提示癌细胞扩散可以出现在早期患者中。因此，检测乳腺癌CTCs有助于及早确定复发、转移的高危患者，通过及时治疗干预，可以阻止肿瘤的复发转移。研究表明，转移性乳腺癌患者在治疗前、治疗中和治疗后的CTCs水平均与其预后密切相关，CTCs可作为转移性乳腺癌患者独立的预后因子。 临床上结直肠癌的CTCs检测主用是针对于上皮细胞EpCAM标志以及标志物CKl9、CK20、CEA等。研究发现，CTCs对结直肠癌早期诊断具有潜在的应用价值，在结直肠癌早期患者外周血中就能检测到CTCs，提示CTCs检测对结直肠癌的诊断有所帮助。CTCs的存在与肿瘤原发灶分化程度无相关性，但与其临床分期具有相关性。Sastre等[17]使用CellSearch系统检测94例大肠癌患者的外周血CTCs，将CTCs≥2个/7.5mL外周血定义为阳性，结果显示阳性率为36.2％（34/94），CTCs阳性率与结肠癌的临床分期相关（II期20.7％，Ⅲ期24.1％，IV期0.7％，P=0.005）。Cohen SJ等研究认为CTCs检测的临界值>3个细胞最有价值，成为治疗前和治疗中结直肠癌无进展生存时间（PFS）和总的生存时间（OS）的观测指标[18]。 CTCs在局限性前列腺癌的临床应用中目前仍存在一定争议，但在进展和转移性前列腺癌的临床应用中得到广泛认可。Danila等[19]对120例去势抵抗性前列腺癌患者外周血采用cellSearch系统进行CTCs检测，发现基线CTcs计数及化疗过程中数目的变化与总生存期的关系；研究发现，99例血样（82％）中检测到CTCs，其中69例血样（57％）基线CTCs计数≥5，且治疗前后CTCs计数均≥5的患者预后较差，治疗后CTCs计数<5的患者有着相对较好的预后，说明CTCs计数及治疗后数目的变化均是总生存期的独立预后因素[20]。Onstenk等[21]研究发现，对去势治疗抵抗性转移性前列腺癌，在肿瘤治疗的不同时间点，外周血CTCs计数是其总存活率的较强的、独立预后因素，而且作为早期标志物，CTCs比传统的血清PSA水平检测更具优势。 目前，传统的血清学标志物如AFP、CAl9-9、CEA、CAl25的联合检测不能早期反映肿瘤的转移情况，而CTCs的特异性和敏感性均高于传统方法。2004年Vona等[22]首先利用ISET法对44例肝细胞癌患者进行了CTCs检测的临床应用的研究。44例患者中，有23例检出了CTCs，检出率为52%，而在健康志愿者、慢性活动性肝炎及肝硬化患者中未检出CTCs。近来的研究表明，肝癌患者病情状态与血液中CTC的数量也显示出极强的相关性。Sun等[23]对123例HCC患者的CTCs研究发现，CTCs检测可作为肝癌患者术后治疗效果的监测指标，并有望成为肝癌术后复发的独立预测指标。Labgaa等[24]总结了肝癌CTCs相关文献，认为外周血CTCs与包括肝癌TNM分期、Okuda分期、BCLC分期、Milan分期在内的肝癌分期呈正相关。进一步研究发现，外周血CTCs也与门静脉癌栓、微血管癌栓、肝内转移、肝外转移、术后复发有统计学相关性，与患者性别、年龄、有无肝硬化、乙肝表面抗原、肿瘤数目、肿瘤大小、肿瘤分化程度无关；手术前CTCs阳性的患者术后肿瘤复发的危险度较CTCs阴性的患者显著升高；且肿瘤预后与CTCs数量有显著关系，外周血中CTC数目越多，患者的无病生存期（Disease-free survival，DFS）和总生存期（Overall survival，OS）越短，预后越差。 肺癌的早期发现、早期诊断一直是困扰着临床的难题之一。在早期肺癌（肿瘤直径小于0.1cm），其外周血中就可检出CTCs，可为肺癌的早期发现及诊断提供重要依据。Allard等[25]采用Cellsearch系统检测了99例肺癌患者（大多为NSCLC）的168个样品，结果显示，肺癌患者外周血中CTCs数目≥2、≥5、≥10和≥50的患者分别占总患者的20%、14%、10%和6%，平均60%的肺癌患者外周血中存在CTCs。研究发现，外周血中循环肿瘤细胞存在以及数量与肺癌肿瘤分期具有相关性。Chen等[26]对473例NSCLC、227例良性肺部疾病以及56例健康对照的CTCs研究发现，NSCLC组CTCs水平明显高于良性肺部疾病组，具有较高的敏感性（22.46%）和特异性（88.65%）。与Tanaka等的研究发现一致，其对125例肺部恶性肿瘤和25例肺部非恶性肿瘤患者研究结果显示肺部恶性肿瘤患者的CTCs计数明显高于非恶性肿瘤患者，并且SCLC患者CTC计数显著高于NSCLC患者，CTC计数随着肺癌分期的增高而明显增多，尤以Ⅳ期且伴远处转移的患者CTC计数最高。也有研究发现CTCs水平随肿瘤直径增大、分化程度降低、骨转移及肝转移的出现而升高。Nagrath等发现在评估化疗的疗效上，CTCs数量的改变与按照实体瘤的疗效评价标准（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST）进行计算机断层扫描（computed tomography，CT）检查的结果具有高度一致性。化疗前CTCs计数高的患者预后差，化疗后CTCs计数下降多的患者，化疗效果较好，死亡风险降低，提示CTCs对广泛期的小细胞肺癌具有预测作用，并且化疗后CTCs计数的改变可以提供有价值的临床信息，指导后续治疗。 早期胃癌往往临床症状不明显，当出现明显症状时，已到中晚期，失去了治疗的最佳时机。因此早期诊断、治疗胃癌是提高患者生存率的关键。CTCs对胃癌特别是早期胃癌的发现及诊断目前尚处于探索和研究阶段。李熳等对45例胃癌患者CTCs进行了检测，其中27例（60%）检出有CTCs，CTCs阳性与淋巴结转移、远处转移和复发密切相关，而与性别、年龄、肿瘤部位和TNM分期、肿瘤分化程度无关[27]。曹中正等于2014年报道了运用免疫磁珠法阴性富集CTCs并行免疫荧光原位杂交检测技术[28]。41例胃癌患者中CTCs阳性率为63.4%，24例良性胃病（胃溃疡或慢性胃炎）患者CTCs阳性率为8.3%。且发现胃癌患者外周血中CTCs水平升高与TNM分期无关，胃癌早期阶段外周血中便可检出CTCs，提示可能在肿瘤早期阶段即发生微转移。Hiraiwa等利用CellSearch System发现外周血中CTCs≥2组总生存率显著低于CTCs<2组；Matsusaka等人则发现CTCs≥4组的化疗病人总生存期和无进展生存期要显著小于CTCs<4组，提示CTCs水平也许与化疗药物治疗反应相关。 4 主要循环肿瘤细胞检测仪器简介 美国FDA在2004年、2007年和2008年分别批准了美国强生公司子公司Veridex开发的Cellsearch CTCs检测技术用于转移性乳腺癌、结直肠癌与前列腺癌的预后评估、无进展生存期和总生存期的预测。Cellsearch也是目前唯一被FDA批准用于临床的检测系统。2007年美国临床肿瘤学会（American Society of Clinical Oncology，ASCO）将CTCs纳入了肿瘤标志物范畴；2012年国家食品药品监督管理总局（China Food and Drug Administration，CFDA）批准Veridex的CellSearch系统用于检测CTCs以评估转移性乳腺癌的预后；2013年CTCs检测被纳入美国医保；2016年初CFDA批准了格诺思博生物科技有限公司自主研发的首个肺癌循环肿瘤细胞检测-叶酸受体阳性CTC检测试剂盒（注册证编号：国械注准20163400061）。该试剂盒采用了国内原创的靶向PCR CTC检测技术，显著提高了CTC检测的敏感性。 自2004年，Cellsearch检测系统获得美国FDA的认证后，10多年间CTCs检测技术及检测仪器突飞猛进，涌现了许多专注于CTCs诊断的公司，生产的检测仪器品牌有四十几种之多[29]，包括强生Veridex公司、凯杰公司（Qiagen）、Epic Sciences、CytoTrack、Codiak BioSciences、Illumina、Thermo Fisher以及Celsee Diagnostics等等。以下简介几种作者认为较有代表性的CTCs检测仪器： 4.1 Cellsearch CTCs检测系统 Cellsearch CTCs检测系统是Veridex公司（Veridex公司是强生的一个子公司）专有的一项技术，是一种高效的、半自动化的CTCs检测系统。该系统采用一种独创的称为铁磁流体的抗体，这种铁磁流体可同铁微粒相结合，且与CTCs表面的EpCAM+/CK+/CD45+等受体有极强的特异性结合的能力，系统用磁场将CTCs分离之后进行生物或化学染色，细胞表面具有EpCAM+/CK+/CD45+被识别为肿瘤细胞。该系统包括三部分：⑴细胞收集保存管：采集并完善保存细胞使样本可在室温下保存小时，方便批量处理和远途运输；⑵样本准CellTracks® AutoPrep®系统：采用自动化可复验的样本准备，可自动化样本快速分析，以得到更精确的结果；⑶样本分析CellTracksAnalyzer II®系统：可自动化样本快速分析。Cellsearch CTCs检测系统既可以用于体外诊断也可供研究使用，同时将微量细胞进行分析的过程半自动化、标准化，使其成为一个简单的三步流程。 4.2 Celsee PREP Celsee PREP是美国Celsee Diagnostics公司生产的全自动循环肿瘤细胞富集和检测平台。其产品包括CTC富集和检测系列CelseePREP100 、Celsee PREP400以及图像分析仪Celsee ANALYZER。与其它免疫学与免疫磁珠、离心等富集分析方法不同，其而不依赖于特定的标志物，而是通过肿瘤细胞的物理特性来捕获富集。在现有使用过滤方法富集CTC的产品中，Celsee是第一个无需预先去除红细胞、高度自动化、高效率富集CTC的产品，并将细胞富集系统与细胞鉴定和分析系统整合到一起。该系统能够处理全血液样本，不需要提前预处理。Celsee PREP400利用微流体动力学，能实现多通道全自动化处理血液样本，是多通道全自动的CTC富集和检测系统，实现从样品到结果的一步到位。Celsee PREP产品能在不添加标记、不依赖于特定标志物的情况下实现CTC富集和回收，并能直接对富集的细胞进行免疫化学、DNA FISH、或者mRNA FISH等实验并能保证细胞活性。Celsee ANALYZER的五色成像系统可对CTC特征、数量和细胞种类进行高度自动化、高通量的分析，以便研究人员更好地理解癌细胞的突变和异质性。 4.3 CytoQuestTM 亚诺法（Abnova）[30]推出的CytoQuestTM CR是以分子亲和力为基础，利用对温度敏感的奈米柱阵列捕捉及释放循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）的平台。CytoQuestTM CR能够提供高纯度、高存活率的循环肿瘤细胞 (CTCs) 以进行后续的蛋白质生物标记（protein biomarker）辨识及基因分析，如荧光原位杂交（FISH）、微阵列以及次世代测序技术（NGS）。对临床医学研究而言，CytoQuestTM CR是一个威力强大的辅助工具，能够帮助辨识与追踪癌细胞的变化和转移。 5 循环肿瘤细胞检测的展望 早期准确地检测CTC对合理地进行综合治疗至关重要，并可作为治疗效疗评估指标及加强辅助化疗的选择性指标，有助于建立个体化治疗方案。然而CTCs是非常罕见的，只是血液中循环细胞的一小部分，因此除了计数以外的分子分析从技术上来说非常具有挑战性。发现CTCs生物学的全貌有助于靶定特异性细胞亚型，从而实现准确用药和个性化治疗的梦想。这不是一件容易的事，因为CTCs不仅罕见，而且异质性是肿瘤的基本特性。尽管目前在CTCs研究方面已经取得了很大的进步，但是多种分离富集与检测方法仍难以满足临床实际工作的需要，每种技术的结果难以统一，理论和实践上都需要制定行业技术标准。如何进一步提高CTCs检测敏感性及特异性、发展适应临床CTCs快速诊断需要的高通量、自动化仪器、完善CTCs检测程序及标准化是今后研究的主要方向。CTCs检测的前景不仅仅在于其对肿瘤的诊断、治疗、监测，分选出的CTCs对化疗药物敏感性检测用于指导个体化治疗是临床亟需和期盼的。 参考文献略 |
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