测序技术变迁史：从Sanger测序到单分子测序

2015-7-30 23:27| 编辑: 小桔灯网| 查看: 2401| 评论: 0|来源: 诺禾致源作者：曾芸芸

摘要: 1977年第一代DNA测序出现至今，测序技术发展迅猛。测序作为基因组研究的基石，每一次技术的变革都对该领域都产生巨大的推动作用。第一代测序技术测序原理：双脱氧链终止法由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DN ...

1977年第一代DNA测序出现至今，测序技术发展迅猛。测序作为基因组研究的基石，每一次技术的变革都对该领域都产生巨大的推动作用。

第一代测序技术

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测序原理：双脱氧链终止法

由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。

缺点：操作步骤繁琐，难以自动化，不能满足大规模测序的要求。

里程碑事件：第一个基因组测序完成——利用Sanger测序技术完成了phi X174噬菌体基因组，基因组大小5.836K。

第二代测序技术

一、454测序仪技术应用

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基因组DNA片段化，文库构建；
文库固定在磁珠上，乳液PCR；
携带DNA的磁珠放入PTP板，每个PTP孔只能容纳一个磁珠；
在每个小孔中放入吸附焦磷酸测序所需酶的小微珠；
微珠置入前芯片图像；
将PTP板放置在GS FLX中测序(i)液体试剂供应装置；(ii)反应池；(iii)光线探测成像系统和计算机控制系统

二、Solexa测序技术原理：边合成边测序

文库制备：片段选择，末端修复加A，接头连接，片段选择；
cBot成簇：连接DNA片段，桥式扩增，成簇，退火测序引物；
测序：加入带有4种荧光标记的dNTP（可逆终止子），每个循环只能掺入单个碱基，激光板扫描版读取

三、SOLiD测序原理：连接酶测序

文库构建；
模板磁珠制备：DNA片段乳液PCR；
磁珠固定：随机固定在测序玻片表面，增加每个玻片的测序密度；
边连接边测序：用四色荧光标记寡核苷酸；
测序引物重置：双碱基编码矩阵，每个模板选择5个引物进行连接反应。

第三代测序技术

一、单分子测序

DNA模板与DNA聚合酶结后，将聚合酶交联到纳米孔底部的基底膜上，每个孔中仅有一条DNA模板序列进入。加入带荧光的dNTP后，DNA开始合成，在激光激发下，每合成一个碱基就发出一次荧光；
DNA合成时，荧光分子自动释放，实现了实时测序，平均读长可达3kb以上，由于单分子荧光信号较弱，且测序的过程非常快，因此错误率较高。

二、半导体测序

DNA分子在微孔内合成，加入不同的碱基产生的PH值和能量的变化不同；
每个微孔的底部传感器可以即时感应微孔内PH和能量的变化，从而识别不同的碱基插入；
每张芯片上存在上百万个微孔，从而可以实现百万条序列同时测序；
每个微孔根据PH值和能量的变化，输出每个碱基测序的质量值。

三、纳米孔测序

借助核酸链堵塞纳米孔时引起的电流强度改变来测序。图左侧是典型的电流强度图，从图中可见，纳米孔通道通畅时（右上图）和被DNA链堵塞时（右下图）的电流强度是有明显区别的，但是无法区分堵塞纳米孔通道的12bp核苷酸的组成；
核酸外切酶测序。图中淡蓝色的核酸外切酶通过深蓝色的接头连接在α溶血素纳米孔的顶端，外切酶逐个切下DNA链末端的dNMP（金色），然后dNMP进入纳米孔中，通过红色的氨基化环糊精配体，引起相应的电流改变，从而被检测出来；
使用合成DNA和光读取技术测序。待测DNA链中的每一个核苷酸都被替换成更长的由橙色和蓝色碱基组成的寡聚体，每一个待测核苷酸都被12bp的寡聚体替代。将这种转换后的新 DNA链与分子信标杂交，杂交链在通过纳米孔时分子信标会脱落，释放出荧光，读取这些荧光就可以推测出原始DNA链的序列；
借助横向隧穿电流测序。纳米孔中装载有橙色的电极和黑色的后门，当DNA链通过纳米孔时，横向的隧穿电流会发生变化，并且每一种核苷酸都有其各自独特的横向电流，因此可以借助这些电流来测序。

来自加拿大和英国的研究人员采用牛津纳米孔公司（Oxford Nanopore）的掌上基因组测序仪MinIONTM，首次测序和从头组装了活体生物——大肠杆菌的全基因组，并发表在6月15日的Nature Methods上，我们期待未来纳米孔测序可以完成更为复杂的生物测序工作。

四、光学图谱技术

通过限制性内切酶对DNA进行原位切割，切割后的DNA片段顺序保持不变；
在切割的位点处加入DNA聚合酶；
DNA 片段经荧光染料染色后置于荧光显微镜下，采集每个限制性内切酶片段的大小和顺序的信息，信息经转换处理后生成单个DNA 分子的限制性内切酶酶切位点图谱。

最后根据全部DNA分子限制性内切酶酶切位点图谱的相互重叠部分拼接得到全基因组限制性内切酶酶切位点图谱。

光学图谱技术提供了一种全新的基因组测序和拼接策略，虽然该技术不能直接获得基因组DNA的碱基序列，但它可以提供基因组绝大多数Contig的位置和顺序信息，从而辅助基因组的Scaffold构建。

总结一下

介绍了这么多，可以看到现有测序技术各自的局限性，为了实现对一种复杂的全基因组进行从头测序，有时需要几种测序技术相结合，协同为后续全基因组组装提供准确有效的信息，从而绘制高水平全基因组图谱。

那么，面对各种各样的测序数据，如何构建高质量全基因组图谱呢？基因组学策略系列之二敬请期待。

参考文献

1. Sanger F, Nicklen S. DNA sequencing with chain-terminating. 74, 1977, 5463-5467.

2. Mardis ER. Next-generation DNA sequencing methods. Annual review of genomics and human genetics. 2008, 9, 387-402.

3. Shendure J, Ji H. Next-generation DNA sequencing. Nature biotechnology. 2008, 26, 1135-45.

4. Metzker ML. Sequencing technologies-the next generation. Nature reviews. Genetics. 2010, 11,31-46.

5. Niedringhaus TP, Milanova D, Kerby MB,et al. Landscape of Next-Generation Sequencing Technologies.2011, 4327-4341.

6. Rothberg JM, et al. An integrated semiconductor deviceenabling non-optical genome sequencing. Nature,2011, 475, 348-352.

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