使用手机供电的一体化CRISPR核酸检测微流控平台

在本核酸检测系统中，Cas9为核心分子识别元件，可通过LFA或电化学分析进行双模式核酸检测。LAMP扩增与电化学检测模块集成于同一装置中，简化了工作流程，并提升了诊断平台的便携性（图a）。

通过sgRNA实现可编程的DNA结合，激活Cas9核酸酶（图b），并可通过LFA检测生成条带（图b）。在电化学高灵敏度定量分析中，将Cas9:sgRNA复合物固定在电极表面作为分子识别单元，RuHex作为电活性的探针，通过差分脉冲伏安法（DPV）监测电流变化，评估探针结合的变化，从而将Cas9与特定核酸靶标之间的分子识别事件定量转化为电信号。

整个平台由电子控制模块和微流控子系统组成（图c），整合含便携恒电位仪、温控模块的电子控制单元与集成LIG加热器、电化学传感器的微流控芯片，搭建出仅靠手机供电、带3D打印外壳的一体化便携核酸检测平台。

作者优化了Cas9-LFA反应条件。使用热循环仪时，LAMP和Cas9孵育20分钟即可产生可见LFA测试线。LIG片上LAMP低功耗加热也能支持后续Cas9-LFA检测。LFA检测本身需要足够多的扩增产物才能产生可见条带。作者通过不同PCR循环数和定量DNA稀释实验估算，LFA读出所需的目标DNA量大约为1×10¹¹ copies/20 μL（5×10⁹ copies/μL）。结果说明了只要扩增产物量足够，LFA可以提供简单直观的结果。因此，LFA更适合作为强阳性的现场定性读出，但不适合低丰度或弱阳性定量判断。

作者还将该体系用于真实世界污水样本中的SARS-CoV-2检测。作者用柱纯化获得的污水总核酸进行RT-LAMP，再进行Cas9-LFA检测。污水核酸经过60分钟RT-LAMP后，在Cas9孵育40分钟以上时可出现目标条带。作者使用的sgRNA跨越SARS-CoV-2 Omicron相关S基因H69/V70缺失区域，因此能够识别Omicron相关序列背景。结果显示，污水中SARS-CoV-2拷贝数变化与住院人数和ICU入院趋势具有一定的相关性（如下图b）。

作者又开发了更灵敏的Cas9电化学检测模块。将Cas9:sgRNA复合物固定在电极表面作为分子识别单元，RuHex作为电活性的探针，通过差分脉冲伏安法（DPV）监测电流变化，评估探针结合的变化。作者最终采用Cas9 200 ng/μL、DNA孵育10分钟、RuHex 50 μM、孵育5分钟。EIS结果显示，随着DNA浓度增加，电荷转移电阻逐渐升高，检测限为5×10⁶ copies/μL（下图f）。

电化学的单碱基分辨能力也优于LFA。实验结果显示，LFA和电化学平台在sgRNA与目标完全匹配时均产生更强信号，单碱基错配时信号明显减弱。但电化学检测在匹配和错配之间给出的信号差异更清楚，因此对单核苷酸分辨更有优势。

最终集成的微流控系统芯片包含两个串联腔室。前端是LAMP加热腔，背面有LIG加热器用于精确控温，后端是电化学检测腔，内嵌Cas9传感电极。流体转移由三个手动PDMS微泵控制，依次完成扩增产物转移、RuHex加入和DPV缓冲液冲洗测量。所有组件均封装在3D打印的外壳中，确保了紧凑的组装和协调的运行。

作者用低至5 copies/10 μL 的DNA溶液验证微流控平台。结果显示，LAMP扩增10分钟后出现弱电化学信号，20分钟后信号清晰，30分钟达到较强峰值（下图e和f）。也就是说，系统在30分钟检测窗口内可检出极低拷贝靶标。