扒一扒反转录，我们真的会做测序实验吗？（四）

清晰地阐述了为何选择GSP，以及该方法旨在替代耗时更长的细胞感染-抽提DNA流程。

列出了优化后选定的商业化病毒裂解液（含RNA酶抑制剂）、反转录预混Mix（支持外源添加GSP）、高保真PCR酶、以及她精心设计并验证过的GSP序列。

从病毒样本接收、裂解处理、反转录体系配制、PCR扩增，到产物电泳鉴定，每一步的操作细节、注意事项、关键控制点都写得明明白白。

附上了三份不同来源LV病毒样本，使用该方法成功扩增出500bp和1000bp目的片段的电泳图，重现性看起来不错。

“很好！”我合上文件夹，由衷地赞赏，“逻辑清晰，数据扎实。你已经完成了一个新方法从探索到建立的‘从0到1’的关键一步。这份SOP，已经可以指导一个熟悉分子实验的人，大概率能重复出你的结果了。”

听到她提出这些问题，我甚感欣慰。她的思维已经超越了“做出结果”的层面，开始触及方法开发的核心——方法性能确认。这正是我希望引导她进入的下一阶段。

“你问到了点子上，一份SOP，是行动的‘地图’。但地图的可靠性，需要评估。你现在感觉的‘不踏实’，正是因为缺乏对这份‘地图’在各种‘地形’和‘天气’下性能的系统评估。我们接下来的任务，就是从‘地图绘制者’，变成‘地图评测师’。”

“没错，这是一个非常关键的自我定位。”我肯定道，“在我们的场景里，它属于 ‘科研/内部质控级别’ 。

 “对的，所以，我们的性能确认工作，不是要像药企或临检中心那样‘大而全’，而是要 ‘小而精’、‘务实’ ，紧紧围绕我们自身的检测需求和可接受的误差范围来设计。”我回答道

“那么，基于我们‘科研级别’的定位，以及这个方法主要为了解决‘长片段扩增’和‘快速检测’这两个痛点，你认为我们需要优先确认它的哪些性能呢？”我把问题抛回给她，期待她能运用之前学到的“拆解”和“排序”思维。

“很好，抓住了一个核心。”我鼓励道，“还有呢？我们开发这个方法的初衷是什么？”

“非常对。这两点直接关系到方法的可用性范围。”我在白板上写下“1. 最低检测限（灵敏度）”和“2. 有效扩增长度”。

“还有一点，你可能忽略了，但它对于确保SOP在不同时间、不同操作者手中都能稳定运行至关重要。”我提示道，“你SOP里选定了一款商业化的病毒裂解液，你对它有多了解？不同批次之间效果一致吗？开封后能稳定多久？”

“是的。不过，我们不需要像厂家那样做完整的加速稳定性实验。”我补充道，“我们可以做一个简单的内部筛选稳定性测试。比如，将同一批裂解液分装，在不同时间点（如刚开封、1周后、1月后）使用同一份已知阳性的病毒样本进行测试，观察扩增效率是否有显著下降。这能给我们一个实用的‘保质期’参考。”我在白板上写下“3. 关键试剂（裂解液）的稳定性”。

看着白板上列出的三项，我总结道：“所以，我建议我们现阶段，就集中精力确认这三个指标：最低检测限、有效扩增长度、内部筛选的裂解液稳定性。”

“问得好。这正体现了‘务实’和‘与责任匹配’的原则。”我详细解释道：

最低检测限（灵敏度）： 这是我们防止漏检的第一道保险。我们的项目有时会处理滴度较低的病毒样本。确认了LOD，我们就知道，当病毒量高于某个水平时，这个方法能可靠检出；低于这个水平，我们就需要谨慎看待阴性结果，或者考虑启用备份方案（如细胞感染法）。这对于风险评估和结果解读至关重要。

有效扩增长度： 这直接定义了方法的能力边界。我们开发它就是为了突破长片段瓶颈。确认这个指标，能让我们清晰地告诉团队：这个方法适用于多长范围内的片段检测。如果未来有更长的测序需求，我们能提前预判是否需要进一步优化或另寻他法。这避免了未来的盲目尝试和资源浪费。

内部筛选的裂解液稳定性： 这确保了方法的操作稳定性和可传承性。一个受关键试剂批次或储存时间影响很大的方法，是不能作为可靠SOP下发的。这个简单的内部测试，成本极低，却能极大增强我们对流程控制力的信心，保证不同人、在不同时间，只要遵循SOP，就能获得可比的结果。

“至于精确度（重复性），”我继续说，“你初步的三次重复数据已经显示了良好的趋势，我们可以将其作为SOP内的常规要求（如规定关键样本需做复孔），而不需要专门设计复杂的精密度验证实验。特异性方面，由于我们使用的是针对特定序列设计的GSP，且最终以测序为金标准，其特异性先天就比较高，我们可以通过阴性对照（无模板对照、无关病毒对照）来日常监控，这已经能满足科研级别的需求。”

我看着她，强调道：“方法性能确认不是学术论文里的‘炫技’，也不是盲目照搬法规条款。它的核心目的是用最合理的资源，获得足够的信息，以确保该方法能够‘胜任’其被赋予的具体任务，并将相关的风险控制在可接受、可管理的范围内。 对于我们这个内部研发辅助方法来说，确认了上述三点，它的‘性能画像’就已经足够清晰和实用了。”