在上一篇文章，统计学角度：为什么微滴生成数下降会影响检测灵敏度？，我们探讨了ddPCR中“雨滴”（中间态荧光微滴）的形成原因及其对阈值设定的挑战。面对这片不可避免的“雨区”，实验人员不能仅凭经验“一刀切”，而需要掌握系统性的处理方法。本文将深入介绍两种核心策略：从源头上减少“雨”的产生，以及利用智能算法对“雨”进行客观识别与分割。 “雨滴”的存在使得阴阳性集群的边界模糊，如果简单地在两者之间画一条直线阈值，会武断地将一部分“雨滴”归入阳性或阴性，导至定量结果出现偏差。因此，科学的处理策略应包含两个层面： 主动优化：通过优化实验流程，从源头上压缩“雨”的宽度和密度，使数据分布更理想，为后续分析奠定基础。 被动处理：当“雨”现象无法完全消除时，借助数据分析软件提供的智能工具，对“雨滴”进行客观识别和分割，将其与高置信度的阴/阳性微滴区分开来，再进行定量计算。 这两种策略相辅相成，结合使用方能获得最可靠的结果。 从源头减少“雨”是最根本的解决方案，主要围绕提高PCR扩增效率和特异性、保证反应均一性展开。以下是一些关键优化方向： 保证模板质量： 高质量的核酸模板是良好扩增的前提。应使用经过验证的提取方法，尽可能去除样本中的PCR抑制剂（如蛋白酶、血红蛋白、肝素、离子螯合剂等）。对于复杂样本，可考虑增加纯化步骤或使用抗抑制剂的DNA聚合酶。 精细优化反应体系： 引物/探针浓度：进行梯度优化，找到信噪比最佳、非特异性扩增最少的浓度组合。过高的浓度易导至引物二聚体或非特异性扩增，形成“雨”。 镁离子浓度：Mg²⁺浓度对酶活性和特异性至关重要。需在厂家推荐范围内进行优化。 退火温度：通过温度梯度PCR找到特异性最佳的退火温度。有时提高退火温度0.5-2°C即可显著减少非特异性产物。 选择优质试剂： 使用高特异性、高扩增效率的热启动DNA聚合酶，可以有效抑制低温下的非特异性扩增。选择高质量的探针（如双淬灭探针）也能降低本底荧光，使信号更清晰。 选择优质耗材： 实验室做过相关移液器与耗材的对比。首先是移液器，可以调节移液速度的电枪及配套耗材配合使用效果最佳，手动移液枪移液速度不稳定，其微滴生成数与前者相比少了将近20%，间接影响了阈值判定。 规范微滴操作： 确保微滴生成仪状态良好，生成均一、稳定的微滴。 微滴生成后，应避免剧烈震荡、反复冻融或长时间置于不适宜的温度下，以防止微滴合并、破裂或试剂降解。 PCR仪 PCR扩增过程应保证温度均一性，避免边缘效应。梯度升温或者降温设置为2℃/s，实验室可自行对比不同PCR仪之间的数据差异，优化实验体系。 合理设计实验 对于预期浓度极高的样本，应进行适当稀释，使其落在ddPCR的线性动态范围内。过高的模板浓度会导至扩增竞争加剧，可能产生更多中间态信号。 尽管经过优化，完全消除“雨”仍然很难实现，尤其对于痕量检测或复杂背景样本。此时，就需要依赖软件的智能分析功能。 目前，主流的ddPCR数据分析软件提供了多种处理“雨滴”的工具，其核心思想多基于聚类分析，旨在自动发现数据中自然形成的群体。 QuantaSoft（Bio-Rad）自动与手动阈值 原理与操作： 自动阈值：软件基于所有微滴的荧光强度分布，计算并放置一条阈值线。算法通常基于总体信号的分布特征（如寻找两峰之间的谷底），但对于有明显“雨”区的数据，自动阈值可能不够准确或波动较大。 手动阈值：用户根据散点图或直方图，直观地拖动阈值线。这高度依赖操作者的经验，不同操作者或同一操作者不同时间设定的阈值可能存在差异，影响结果的可重复性。
ddPCRquant（R语言包） 原理与操作： 这是一个开源的R语言软件包，其核心算法之一是高斯混合模型聚类。它不预先假定数据只有两类，而是将荧光信号数据拟合为由多个高斯分布（代表阴性、阳性及可能的中间态群体）混合而成的模型。通过期望最大化（EM）算法迭代求解，为每个微滴计算属于各个群体的概率，实现“软聚类”。 Define The Rain （QuantaSoft Pro等版本的高级功能） 原理与操作： 此功能本质上是将类似 K-means聚类或其变体/GMM 的算法封装成了简单的按钮。用户点击后，软件会自动分析荧光散点图，识别出数据中主要的聚集群，并将其中离散度较大、位置居间的群体标记为“Rain”。随后，软件会划定“雨区”的边界，用户可以选择将这些微滴排除在后续的绝对定量计算之外，仅使用明确的高置信度阴/阳性微滴进行计数。 对于大多数用户，QuantaSoft的自动和手动阈值仍是第一道分析关口。以下是具体处理步骤： 1. 数据加载与查看： 运行结束后，在QuantaSoft中打开数据文件 软件默认会显示1D振幅图（直方图）和2D散点图（FAM vs HEX）。重点关注目标通道的分布。 2. 使用自动阈值： 在“Analysis”设置中，确保“Threshold”设置为“Automatic” 软件会立即计算并在图上显示一条自动阈值线（黄色垂直线）。在2D图中，则显示一个自动阈值区域。 处理：观察自动阈值线是否合理地分离了阴/阳性云团。如果“雨”不严重且两团分离清晰，自动阈值通常可用。记录下此时的阳性计数和浓度。
图片来源：BIORAD-Droplet Digital PCR Application Guide
图片来源于：BIORAD-Droplet Digital PCR Application Guide 3. 转入手动调整： 当自动阈值明显不合理（如切入了密集的阴性或阳性云团中），点击阈值线并拖动到您认为更合适的位置。 调整原则： 在1D图中，将阈值置于阴性和阳性分布之间的“山谷”最低处。
在2D图中，根据阴性云和阳性云的边界，调整阈值区域。 处理数据：调整时，软件会实时更新阳性微滴计数和浓度结果。找到一个您认为能最佳区分信号和背景的位置。 4. 结合“雨”的考量： 即使手动调整，也应意识到直线阈值无法完美处理“雨”。如果“雨区”宽且密，应备注说明，并考虑使用“Define The Rain”功能或第三方软件进行二次分析。 一种折衷的手动策略是：将阈值线略微偏向阴性云一侧，以牺牲少量弱阳性信号为代价，确保阴性判定的特异性，但这会降低灵敏度，需根据实验目的权衡。 5. 记录与报告： 必须记录最终使用的阈值设置（是自动还是手动，手动值是多少）。 报告结果时，注明“雨滴”的大致比例或对阈值设定的潜在影响，这是数据透明度和结果可靠性的重要体现。 处理ddPCR中的“雨滴”，是一个从“预防”到“治理”的系统工程。在日常使用QuantaSoft手动设置时，也应时刻牢记“雨”的存在及其对结果的潜在影响，并通过规范的记录来体现分析过程的严谨性,更精准地计量每一个目标分子。 |
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