核酸检测联合数字微流控：下一代POCT的挑战与前景

近日，杂志Microsystems & Nanoengineering上发表了一篇题为“Nucleic acid amplification tests in digital microfluidics: the promise of next-generation point-of-care diagnostics”的综述文章。文章侧重于最先进的DMF的技术，以及与NAAT工作流程的自动化集成。本文还讨论了商业化努力的最新进展以及DMF技术与人工智能（AI）的集成、挑战和前景。

数字微流控（DMF）通过电场操控离散液滴（如最广泛使用的介质上电润湿EWOD机制），在平面电极阵列上实现液滴的传输、混合、分裂等操作，而无需传统微通道或机械泵（图b）。

DMF设备的核心设计包括基底、‌电极阵列、介电层和疏水涂层‌。常见的结构分为单板开放式和双板封闭式（图a）。封闭式结构底部为电极阵列，顶部为ITO透明导电层，双板夹持液滴，减少蒸发和污染，更适合生物检测。电极材料多采用金、铜或铬，通过光刻或印刷技术使驱动电极图案化。介电层（如聚对二甲苯、二氧化硅）用于绝缘和建立电场梯度，而疏水层降低表面能以实现液滴操控。基底材料包括玻璃、硅、PCB或柔性基板，其中PCB因低成本和多层布线优势适用于批量生产。

DMF的温度控制模块对核酸扩增是必不可少的，常见策略有‌外部加热方法，‌如在DMF装置下放置Peltier元件或铝块加热器，但存在热惯性大和冷凝问题（图a）。加热单元也可以集成到DMF平台中，以实现快速传热到反应部位（图c）。比如可以将电阻（如铂、多晶硅）直接图案化在芯片上，可实现快速PCR的升降温循环。微电极点阵列（MEDA）技术通过CMOS电极调控电流实现多温区控制。最近还开发了一种钳形加热方案，由顶部和底部ITO加热器组成，减少温度梯度并抑制气泡形成（图d）。

数字微流控（DMF）技术通过电润湿原理操控独立液滴，可实现自动化核酸提取。‌固相提取‌磁珠法（MB）是主流方案，通过裂解、捕获、洗涤和洗脱四步流程，可从血液、尿液等复杂样本中高效提取DNA/RNA，与常规核酸提取相比，产率相当的情况下，样本体积可减少10倍。DMF平台通过液滴往复运动增强靶标结合效率，20-30分钟内完成细胞和细胞外囊泡miRNA提取（图a）。

‌液-液提取‌是利用不混溶液相（如酚类）分离核酸与杂质，虽然操作简单但效率较低（图b）。

DMF还可以集成‌预浓缩装置，‌联用蠕动泵或样本腔室处理大体积样本，浓缩至微升级液滴，提升低丰度靶标检出率（图c）。

DMF平台通过集成温控模块支持多种核酸扩增技术。针对PCR，DMF设备常采用双温区设计（如95°C和60°C），通过电极切换实现快速热循环。双温配置消除了加热和冷却过程之间的过渡时间，这使得在40个周期的实时PCR中在12分钟内检测到靶标（图b）。新的策略还包括增加水平温差和减少热区之间的液滴穿梭距离，例如使用热隔离槽，将反应时间缩短到仅5分钟。DMF器件的独特结构可以提供空间编码的内在优点，可支持11种呼吸道病原体的多重检测，灵敏度达12-150拷贝，准确率为99.85%（图d）。

LAMP的恒温特性简化了设备需求，比色法（如SYBR Green）实现可视化检测，灵敏度范围为10-40份DNA拷贝，但可能导至高假阳性率。分子信标探针可以结合LAMP扩增子中的特定序列，并区分非特异性扩增，如气溶胶污染。基于分子信标的DMF-LAMP可以在15-40分钟内检测到低至10个DNA拷贝。超疏水和超亲水微模式也可被集成到DMF装置中，利用EWOD原理将反应液滴从超疏水模式分配到超亲水微模式，在1 min内可生成1818个液滴（图e）。这种数字LAMP能够在60分钟内进行绝对DNA定量。

RPA降低了引物设计的复杂性，并且能够在较低温度较短时间实现敏感和特异性检测，获得了新的关注。有源矩阵DMF装置可以独立控制大量RPA反应液滴，体积低至45 nL，可以使用荧光在15分钟内以单拷贝灵敏度检测大肠杆菌blaCTX-M-15耐药基因（图a）。有源矩阵DMF的一个关键优势是可进行广泛的多路检测，并增强了对体液进行精细处理的能力。CRISPR与RPA联用，可使检测更加灵敏，比如用于检测鼻咽拭子样本中的流感病毒和SARS-CoV-2，以及尿液和牛奶中的细菌病原体（图b）。

还有其他基于DMF的等温核酸扩增技术，比如滚环扩增（RCA）可检测1 aM合成DNA，EXPARR在37°C下45分钟完成HIV检测。

尽管DMF对NAAT具有优势，但挑战依然存在。首先，标准DMF在分子诊断方面的吞吐量有限，因为可以在基底上形成图案的电极数量有限。标准DMF仅40-80电极，新的趋势是采用有源矩阵技术，可扩展数万个电极，适合数字PCR等高通量应用。其次，大多数DMF设备由高压供电，需要手动加载样品和试剂，并依赖有线数据传输，这对POCT环境中造成了障碍。纸基DMF和摩擦电纳米发电机（TENG）驱动有望降低偏远地区使用门槛。同时，在芯片上预先储存脱水试剂（反应混合物，探针或指示剂）可以作为一种替代方法，减少了在NAAT工作流程中手动移液的需要。

未来，人工智能驱动的智能DMF系统将基本确保完全自动化的场景和在线实验编程。随着无线通信、物联网和数据云的普及，数据传输的安全性得到了保证，智能医疗行业正朝着芯片医院的方向发展。总之，标准化的基础设施、便捷的制造和通用的控制系统将激发DMF当前的生态系统，使其更容易被广泛的用户使用。

DMF-NAAT平台通过“样本进-结果出”的自动化设计，正重塑分子诊断的即时性和可及性。尽管面临电极稳定性、多目标兼容性等挑战，但其与AI、纳米材料的交叉创新，将加速其在传染病防控、单细胞基因组学等领域的应用落地。此外，还应解决技术问题和可靠性-成本平衡问题，以使其得到广泛采用。未来，标准化制造和无线物联网集成可能推动DMF成为“医院芯片”生态的核心组件。总的来说，尽管DMF在分子诊断方面具有潜力，但应该考虑小型化、标准化和智能化等方面，以满足任何人、任何地点、任何时间都可以访问的即时护理测试的真正理想。