NGS检测流程--上机测序

一、Illumina平台测序参数设置

1. Run Name（运行名称）：通常录入上机的日期或项目编号，如20241115_Run1。

2. Library ID（文库编号）与Pooling文库号或样本批次编号相关联，如Lib_Pool1_SampleA。

3. Recipe（测序方案）：选择合适的测序流程模板，如NextSeq High、NovaSeq S4等。

4. Read Type（读取类型）：选择单端（Single-End, SE）或双端（Paired-End, PE）测序。

5. Read Length（读取长度）：

• Index 1和Index 2：设置条形码的读取长度，通常为8 bp或10 bp。
• Read 1 和Read 2：根据应用需求设置，如150 bp × 2（双端150 bp）。

6. Custom Primers（自定义引物）：仅在特殊应用（如靶向测序、自定义引物扩增）时启用并加载自定义引物文件。

7. Output Folder（输出目录）：指向服务器的存储目录，如/data/sequencing_runs/20241115_Run1/。

二、MGI平台测序参数设置

1. RFID 自动识别测序试剂槽、清洗试剂槽及载片 ID并显示在相应的文本框中；

2. 测序方案设置

• 一链读长和二链读长：单端（SE）或双端（PE）测序的读取长度。例如，PE100表示双端测序，每端读取100 bp。

• Barcode 读长：通常为8-10 bp，用于区分不同样本。

• DualBarcode 读长：如需使用双标签以增加样本识别能力，可设置 DualBarcode 读长。常用于多样本或复杂样本池化的实验。

• 暗反应读长：暗反应是指进行生化反应但不采图的 cycle。设置一链和二链的暗反应读长可以减少数据量，但保留必要的化学反应步骤。

3. 选择相应的标签序列：根据试剂盒或应用要求选择适合的 Barcode 和 DualBarcode 序列，以确保样本间的唯一性。

4. 选择Barcode 和 DualBarcode 是否拆分：如果数据分析需要单独分析不同 Barcode 或 DualBarcode 的数据，可以选择拆分，否则可以选择不拆分。

工具与方法

1. Sequencing Analysis Viewer (SAV)：Illumina官方提供的软件工具，用于实时监控和分析测序运行数据。SAV显示的数据来自测序仪生成的实时文件（如InterOp文件）。

2. BaseSpace Sequence Hub：可选的云平台，支持远程实时查看运行状态和数据。

关键数据

1. 信号强度（Intensity）：

• 每个碱基循环的平均荧光强度。
• 强度较高且均匀表明测序化学反应效率正常。
• 如果信号强度过低，可能是试剂问题、焦点偏移或仪器故障。

2. 碱基识别率（Phasing/Pre-phasing）：

• 表示簇中碱基的同步性。
• Phasing
  ：延迟一个循环的碱基占比。
• Pre-phasing
  ：提前一个循环的碱基占比。
• 这两个指标应尽可能低（<1%为理想值）。

3. 错误率（Error Rate）：

• 每个循环的测序错误率，基于控制DNA（PhiX）计算。
• 错误率过高表明测序化学、焦点或簇密度问题。

4. Q分值（Quality Score）分布：

• Q30分值（碱基识别的准确率 ≥99.9%）的比例是重要指标。
• 通常Q30 ≥ 85%为合格。

5. 簇密度和占比（Cluster Density and Percent Occupancy）：

• 簇密度表明反应池的簇形成情况。
• 占比（Occupied Wells）反映有效簇的比例，过低或过高都会影响数据质量。

二、MGI平台的实时监控

工具与方法

• MGI Online Software Suite：MGI提供的本地或远程监控工具，可以实时查看测序运行状态和关键指标。
• 实时图像与数据分析模块：MGI测序仪直接通过系统界面提供实时数据和图像监控。

关键数据

1. 信号强度（Signal Intensity）：

• 表示荧光探针信号的平均强度。
• 如果信号较弱，可能是试剂反应效率或焦点调整的问题。

2. 碱基识别率（Decoding Efficiency）：

• 反映每个循环的碱基解码准确性。
• 与Illumina类似，通过phasing和pre-phasing值评估解码同步性。

3. 错误率（Mismatch Rate）：

• 测序过程中碱基匹配的错误比例。
• 错误率较高可能与试剂质量、DNB密度、图像处理算法相关。

4. DNB密度与分布：

• 测序芯片上DNB的加载密度和分布情况。
• 过高或过低的DNB密度都会影响测序质量。

5. 实时成像质量：

• 系统提供的实时成像图像，显示DNB上的荧光信号分布。
• 不均匀信号可能提示加载问题或试剂扩散不均。

三、 注意事项和优化建议

• 环境因素监控：确保温度、湿度在测序仪建议的范围内，避免因环境波动影响数据质量。
• 试剂使用：定期检查试剂的存储和混合均匀性，避免试剂降解导至信号偏弱。
• 仪器校准：确保测序仪光学系统和移动部件定期维护和校准。
• 数据实时解读：若发现关键数据异常，应暂停运行或调整参数，避免后续数据质量问题扩大。

测序完成后，数据的保存和初步分析是确保结果完整性和可靠性的关键步骤。这包括原始数据的存储、基础质量评估（QC）、数据整理和初步分析。

一、原始数据的存储：测序仪生成的原始数据包括原始图像、信号强度文件以及初步的碱基调用结果。这些数据需要按科学规范进行保存，确保后续分析的可追溯性。

数据类型与文件结构

• 原始图像文件
  光学系统采集的荧光图像（通常保存为二进制格式，仅在特殊情况下使用）。
• 中间文件
• Illumina平台：包含.bcl文件（Binary Base Call），用于存储每个簇的碱基调用及其质量分数。
• MGI平台：生成的.fastq文件直接包含碱基序列和质量分数。
• 结果文件
• FASTQ文件：通用的碱基序列和质量分数存储格式，是大多数后续分析的输入文件。
• InterOp文件（Illumina）：存储运行日志、簇密度、信号强度等数据，用于质量评估。

数据保存的注意事项

1. 存储设备与路径
• 使用高性能存储系统（如NAS或SAN）以满足高数据量的读写需求。
• 目录结构需清晰，例如按测序日期、实验编号、样本编号进行归档。
2. 冗余备份
• 采用本地和远程双重备份策略，防止单点故障导至数据丢失。
• 可使用RAID（冗余阵列）或云存储服务。
3. 命名规范
• 确保文件和目录的命名一致、清晰，便于查找。例如：RunID_SampleID_Lane_Read.fastq.gz。
4. 数据安全性
• 设置严格的访问权限，避免数据泄露。
• 使用加密存储和传输敏感数据。

二、 数据初步分析的原理与流程

基础质量评估（QC）

• 原理：通过统计分析测序数据的质量指标，判断是否符合分析标准。
• 常用工具
• FASTQC：检测碱基质量分布、GC含量分布、序列重复率等。
• MultiQC：整合多个样本的QC结果，生成可视化报告。
• 关键指标
1. Q分值分布：衡量碱基识别的准确性，Q30分值比例是常用标准（≥85%为合格）。
2. GC含量分布：是否与物种基因组的预期一致。
3. 序列重复率：检测序列是否均一，避免偏好性扩增。
4. 接头序列污染：查看是否存在未剪切的接头序列。

数据整理与清洗

• 去接头与低质量序列：使用工具（如Trimmomatic或Cutadapt）移除接头序列、低质量碱基和过短的片段。
• 去除污染序列：通过对比（如使用BLAST或Kraken）移除可能来自污染源的序列。
• 结果存储：清洗后的数据需保存为新的FASTQ文件，并按样本编号进行归档。

数据去重（可选）

• 原理：去除PCR扩增过程中产生的冗余序列，避免对下游分析造成偏差。
• 实现：使用工具（如Picard或SAMtools）标记和去除重复序列。

三、注意事项

1. 数据完整性检查：保存和传输数据时，使用MD5校验码验证数据文件是否完整。
2. 质量评估后再进行后续分析：如果发现质量问题（如接头污染过多或低Q值比例高），需重新优化数据处理或重新进行实验。
3. 分析步骤标准化：制定明确的标准操作流程（SOP），确保每次数据处理的一致性。
4. 跨平台兼容性：Illumina平台数据多以BCL格式保存，需先转化为FASTQ格式；MGI平台直接生成FASTQ数据，但可能包含特定字段，需注意兼容性。