为什么分子诊断POCT性能不及实验室检测？——POCT明星产品的启示 ...

2024-5-27 14:13| 编辑: 归去来兮| 查看: 210| 评论: 0|来源: 微流控学习部落

摘要: POCT是一种可由非实验室人员或患者本人在采样现场进行的检测方式

POCT是一种可由非实验室人员或患者本人在采样现场进行的检测方式，其典型应用场景包括基层医疗场所、医院急诊重症科室、突发公共卫生事件一线、家庭等。与实验内检测相比，POCT在检测效率和样本量需求等方面具有明显优势，可在数分钟在数十分钟时间内给出诊断结果，帮助患者和医护人员及时了解病情发展、辅助诊断决策。

然而，有相关统计数据表明^[1-3]，多数情况下POCT在检测限、灵敏度、特异性等方面表现不及实验室内检测，出现错误检测结果的概率更高。这其中有采样环境、人员操作的原因，也有POCT产品自身的原因，今天我们聊的主题是后者。

目前已上市或公开设计的分子诊断POCT产品多基于传统检测方法学原理，将实验室检测工作流复刻至微流控芯片中。而在产品开发过程中，因产品定位、技术限制等因素制约，往往不会完整的复刻实验室检测工作流。即便是保留了步骤的完整性，因芯片中对反应体系的处理方法相对实验室内失真，其实际效果与预期也会出现较大差距。

例如，i. 实验室中样本的前处理，如核酸提取纯化，由于涉及多个步骤和磁珠操控，一般来说较难集成在微流控芯片中。ii. 多数微流控芯片中样本和试剂的混合往往只是简单的流动汇聚，且存在一定的死体积，无法像实验室中一样通过移液枪吹打或者涡旋震荡使反应体系混匀。iii. 微流控芯片扩增腔壁厚普遍高于通用的PCR管壁，且难以像实验室PCR一样进行3D包裹加热，这使得芯片中反应体系的温度控制精度和速度均不及实验室PCR。下面一起看一下分子诊断POCT明星产品是如何通过微流控设计优化来提升产品性能的。

Cepheid Genexpert

实验室检测流全复刻+样本和反应体系处理方式优化

作为最经典的一款分子诊断POCT产品，Cepheid Genexpert在商业上取得了巨大的成功。Genexpert完整集成了样本裂解、提取纯化和PCR扩增步骤，通过多重荧光提升检测通量，最新款产品已升级至十重荧光^[4]。Genexpert并不像传统认知里的微流控芯片，其具有更加立体的外形，Cepheid官方称其为卡盒（cartridge），正是这种立体式的卡盒结构，使得Genexpert可以完整地集成样本前处理步骤。

卡盒内部通过活塞（syringe）抽吸，配合阀体（valve body）切换完成样本和试剂驱动、混合及转移等动作。阀体内置滤膜截留待测病原体，并进行洗涤。随后引入裂解液并在超声波作用下使病原体发生裂解释放出核酸，过滤膜允许核酸透过，而将细胞和病毒碎片截留。最后再将核酸样本与PCR试剂混合，转移至PCR扩增腔中进行扩增和实时荧光定量检测。

不难发现，Genexpert在样本和反应体系处理方面做了一系列的努力。采用了高效的核酸提取和纯化技术，使其可以轻松应对不同样本类型，这样系统也就具有了通用性。样本和PCR试剂混匀优化则通过活塞反复抽吸来实现。此外，系统针对PCR温控精度和效率也进行了优化，其扩增腔（PCR tube）采用了扁平化设计和厚度仅几十微米的薄膜封装，这使得反应体系具有更高的温度响应和精度，最大升温速度达到了惊人的10℃/s，大部分测试的全流程能控制在60分钟以内，灵敏度和特异性指标媲美实验室PCR检测^[3]。

bioMerieux FilmArray

实验室检测流全复刻+PCR方法学创新+样本和反应体系处理方式优化

另一款分子诊断POCT明星产品FilmArray检测袋（pouch）同样将样本裂解、提取纯化、PCR扩增全集成，通过仪器挤压由薄膜构成的各个腔室实现流体驱动。检测袋中微珠研磨使样本裂解样本后释放出核酸并特异性结合在磁珠表面，经过洗涤和洗脱后进行反转录和第一轮PCR扩增，扩增结束后对第一轮扩增产物进行适当稀释，以限制第一轮扩增引物对第二轮扩增的影响，接着对稀释后的产物进行巢式PCR扩增，巢式PCR扩增检测孔中预置有不同的引物，以同时实现多个靶标核酸检测^[5]。

FilmArray的PCR方法学创新在于通过巢式多重PCR的多对特异性引物同时扩增多个靶标核酸。首先进行第一轮PCR，使用外部引物扩增包含目标区域的DNA片段。然后，使用内部引物在第一轮扩增产物内部进行第二轮PCR，从而得到更短、更特异的DNA片段。由于第二套引物结合位点位于第一轮PCR产物内部，因此第二轮PCR中错误扩增的概率非常小，这种巢式PCR设计增加了检测的灵敏度和特异性。

样本和反应体系处理优化方面，与Cepheid Genexpert的设计理念不谋而合，FilmArray检测袋的流体控制板部分采用扁平化设计，通过薄膜封装，这使得反应腔中的PCR反应具有极佳的温度响应性能。反应体系混匀优化则通过反复挤压相邻的两个反应腔，使其中的流体往复运动混匀。

数字PCR

PCR方法学创新

数字PCR方法基于微流控芯片的微腔分割或微流道生成液滴，对PCR反应体系进行微分。微腔芯片中加入含PCR反应体系后，在样本液面上方加入密封油，仪器将样本沿着微流道压入的微米级腔室中，并对每个微腔进行独立油封。微液滴芯片则将PCR反应体系通过油相切割成分散的微液滴。无论是哪一种形式的数字PCR，其核心思路均是对反应体系进行微分切割，扩增完成后进行计数，并基于柏松分布理论对样本中靶标核酸浓度进行分析。

数字PCR芯片技术中，每个微腔或液滴均作为独立的反应单元，对于低浓度样本而言，这就等于提高了样本的浓度，因此数字PCR的检测灵敏度显著高于常规实验室PCR。目前Biorad、Thermofisher、Qiagen、Stilla等公司数字PCR系统基于多重荧光或高通量芯片，基本实现了制样、PCR扩增、结果读取分析一体化，但尚未实现样本前处理全集成，核酸提取和纯化、PCR试剂混合还需要在芯片外完成^[6]。此外，当前数字PCR还普遍存在不同程度的样本死体积问题，这些是数字PCR未来需要继续突破的方向。

结语

在医院或者基层医疗机构场景中，分子诊断POCT产品需满足高灵敏度、高通量等要求，为医护人员高效决策提供支持，因此产品设计采取实验室工作流全集成为宜，全集成的方式在提升检测能力的同时也赋予了产品更高的兼容性，可以处理不同类型的样本。检测通量的提升则可通过多反应腔设计或多重荧光试剂来实现。此外，还需有针对性地进行核酸纯化、混合和温控方法优化，这样才能最大程度保证产品的性能指标媲美实验室PCR检测。而在常规PCR基础上进行方法学创新而发展起来的数字PCR技术，从设计上决定了其具有超过PCR的检测灵敏度，在一些需要绝对定量的细分领域，如液体活检、血流感染检测中，正逐渐建立优势，但其集成度和检测效率还需要进一步提升。

对于定位家庭应用的分子诊断POCT产品，易用性、安全性和便携性无疑是至关重要的考虑因素。与医疗机构使用的POCT相比，家庭应用POCT对检测能力的要求相对较低，但同样需要保证结果的可靠性和准确性。在技术选择上，采用核酸免提取恒温扩增结合电化学传感器或侧向层析的方式或许是具有潜力的方向。从当前市场应用来看，分子诊断POCT的主流技术路线仍然是裂解、提取纯化、PCR扩增全集成的方式，对于家庭分子诊断POCT市场和产品而言，还有待时间的培养和技术打磨，例如，如何抑制体系的非特异性扩增、提高抗干扰能力等。

参考文献

1. Julie L V Shaw, Point-of-Care Testing: The Good, the Bad, and the Laboratory Oversight. The Journal of Applied Laboratory Medicine, Volume 6, Issue 4, July 2021, Pages 1090–1093.

2. Covid-19: Point of care test reports 94% sensitivity and 100% specificity compared with laboratory test，doi: https://doi.org/10.1136/bmj.m3682.

3. Appropriate Use of Point-of-Care (POC) Tests for SARS-CoV-2, Appropriate Use of Point-of-Care (POC) Tests for SARS-CoV-2 (acgov.org).

4. Cepheid官网.

5. bioMerieux官网.

6. Biorad、Thermofisher、Qiagen、Stilla官网.

声明：

1、凡本网注明“来源：小桔灯网”的所有作品，均为本网合法拥有版权或有权使用的作品，转载需联系授权。
2、凡本网注明“来源：XXX（非小桔灯网）”的作品，均转载自其它媒体，转载目的在于传递更多信息，并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责。其版权归原作者所有，如有侵权请联系删除。
3、所有再转载者需自行获得原作者授权并注明来源。