GRAIL圣杯的故事（一）起源及技术开发

2016年初，Illumina宣布Spin out剥离出Grail，专注于泛癌筛查开发。2021年8月，Illumina又以80亿美元完成了对Grail的收购，此举受到各种法律挑战，其中欧盟委员会认定这项收购违反了欧盟合并条例，要求Illumina剥离Grail。在股价下行、伊坎代理大战、管理层洗牌之后，Illumina决定撤资Grail。最近，Illumina宣布Spin-Off分拆Grail。

一出闹剧即将落幕，是时候来梳理一下Grail这个“巨婴宝贝”了。

故事起源

1948 年，法国研究人员Mandel 和Métais 首次报告了人类血液中存在游离DNA (cfDNA)。他们在外周血浆中发现核酸这一事实挑战了之前DNA 总是与细胞相结合的固有观点。然而，由于当时还不知道DNA的结构和功能，他们的发现并没有受到太多关注。

1977年，Leon 及其同事发现癌症患者血液中的cfDNA 水平高于健康人，而转移性癌症患者的水平更高。血液中高出的这部分来自肿瘤的cfDNA通常被称为ctDNA（循环肿瘤DNA），显示出了作为肿瘤生物标志物的潜力。

2014年，研究人员在临床中验证可以从ctDNA中可以检测结直肠癌患者的KRAS/BRAF突变。自此，人们对ctDNA这种生物标志物的兴趣与日俱增，ctDNA成为液体活检的半个代名词。

Grail的想法起源于Illumina，来自一项涉及基于cfDNA的非侵入性产前检测NIPT研究的偶然发现。

这项研究利用全基因组测序来查询拷贝数变化，以通过母体血液中的胎儿cfDNA来识别胎儿染色体异常。在125,426名孕妇的队列中，研究人员惊奇地发现了10例孕产妇癌症病例。在出现晚期症状的癌症病例中，临床医生指出，如果这些恶性肿瘤被及早发现，则会对他们的护理产生积极影响。

虽然ctDNA在很大程度上被用作晚期癌症患者的非侵入性伴随诊断，但这种通过癌症特异性染色体变化对多种癌症类型的偶然检测表明，基于cfDNA的多癌早筛MCED（即当患者还无症状时）是可能的，此后不久Illumina便成立了Grail，致力于这一使命。

开发背景

血液中含有循环的基因组物质，包括癌症患者的cfDNA片段，这使其非常适合检测癌症信号。基因组中一个或多个基因的改变会扰乱细胞的正常功能并导至疾病，比如基因突变可以导至癌症（基因组疾病）。虽然了解个人的基因突变可以帮助诊断和治疗癌症（例如，通过选择已知针对特定突变或一组突变的疗法），但突变只提供了驱动癌症复杂生物学的部分情况。

众所周知，癌症的一个标志是DNA的异常甲基化。甲基化是所有活细胞中活跃的生物学过程，它调节基因表达（即DNA的哪些部分“打开”或“关闭”），从而驱动细胞功能。甲基化位点是基因组上甲基基团沿着DNA链附着在胞嘧啶碱基上的位置。异常的甲基化位点要么是高（通常不甲基化，但随后被甲基化）或低（通常甲基化，但后来不甲基化）。高甲基化会导至肿瘤抑制基因、转录因子和DNA修复机制的沉默，从而增加肿瘤形成的可能性。低甲基化会导至基因组不稳定和染色体重排。甲基化模式的改变可能导至蛋白质水平的变化，这可能会引发细胞功能的变化并导至疾病，包括癌症。此外，由于体内每种细胞类型都有独特的甲基化模式，或“指纹”，因此甲基化模式的评估可以确定癌症信号来源。

ctDNA（及其甲基化模式）可以从细胞中进入血液。血液中的短DNA片段即cfDNA，来自体内几乎所有的细胞类型，包括正常细胞、病变细胞、癌细胞、寄生虫、细菌和病毒等微生物，以及孕妇的胎盘。可以对进入血液的cfDNA片段进行测序，其确切的序列特征和甲基化模式等可用于识别疾病并确定其起源位置。

从血液中测序cfDNA的能力允许直接调查许多类型癌症共有的相似的甲基化模式。为了成功地将cfDNA测序技术开发成有效的、高度特异性的MCED测试，必须克服一些技术、生物和临床挑战。特别是，由于血液样本中存在的ctDNA非常少，测序分析必须达到足够的检测限LoD，以从cfDNA中捕获来自肿瘤的信号，并能够将该信号与其他混杂的无症状健康人群的噪音区分开来。

技术平台开发

Grail开发了一个甲基化检测平台，包括湿实验室工作流程和机器学习算法，通过有效查询血液中cfDNA片段上的100多万个甲基化位点来识别共享的癌症信号。基于这一甲基化平台诞生了第一个MCED测试：Galleri。

Grail的湿实验流程基于亚硫酸盐测序流程，尽可能保留DNA甲基化信号。Grail又投入了大量资金建立了前所未有的高质量、相互链接的、人口规模的临床和基因组数据的纵向数据集。复杂的机器学习算法有效地分析这些非常大的数据集，并将癌症信号与技术噪音、生物噪声区分开来。同时，随着时间的推移，数据集不断增长，这一算法又可以继续学习，并得出新的生物见解，有助于实现产品改进和新产品开发。

一开始，为了确定检测血液中癌症信号的最有效方法，Grail采取了全面和无偏见的发现方法来评估多个NGS检测原型。为此，他们设计了循环无细胞基因组图集CCGA研究，以表征癌症患者和非癌症患者血液中基因组信号的范围。目标是开发和评估计算模型，以区分癌症cfDNA和非癌症cfDNA，并开发机器学习算法来识别和定位体内的癌症信号。值得注意的是，非癌症参与者包括年龄、性别、种族、吸烟状况、体重指数和并发疾病等癌症风险因素的人，这增加了这项研究的普适性。这项研究指导了Grail甲基化平台的开发、完善和临床验证。

Grail开发的多个原型检测包括：使用靶向测序测量单核苷酸变异（“SNV和InDel”）来评估癌症衍生的突变（有和没有白细胞（“WBC”）的噪声去除）；使用全基因组测序（“WGS”）来分析体细胞拷贝数改变（“SCNA”）和片段特征，如长度和末端；以及使用全基因组亚硫酸盐测序（“WGBS”）来识别甲基化模式。

对比结果表明，表征甲基化模式的WGBS方法与其他检测方法一样好或更好，无论是单独还是组合使用，并显示出进一步优化的最大潜力。Grail能够发现在50多种癌症类型中共享的一些甲基化特征，而且甲基化检测在确定癌症信号来源方面表现更好。

在对CCGA研究相关的全基因组甲基化模式进行全面分析后，Grail确定了用于癌症信号检测和癌症信号起源检测的信息量大且低噪声的甲基化位点。这些低噪声位点不太可能受到混杂条件（如衰老、炎症条件）和非癌细胞cfDNA引起的生物噪声的影响。基于此，Grail转向了靶向甲基化方法的开发，只需要查询基因组中这些特定的甲基化位点，评估其甲基化模式，这构成了Galleri测试开发的基础。

描述CCGA发现方法的数据于2022年发表在《癌细胞》上。

技术优势

Grail的原型MCED测试中使用的cfDNA全基因组甲基化在癌症信号检测和癌症信号来源预测方面表现强劲，无需额外的测序来纠正来自WBCs的DNA造成的高背景噪声。重要的是，随后开发的靶向甲基化方法，与全基因组甲基化相比，也具有卓越的性能，更实现了更低的成本。

靶向甲基化在癌症检测和癌症信号来源方面优于WGS和靶向测序，可能有多方面的原因。

首先，与传统液体活检方法中通常查询的突变位点相比，甲基化在基因组中更普遍，这使得其在cfDNA固有的低信噪比背景下更加稳健。与只影响少数基因组位置的典型癌症突变相比，整个人类基因组有近3000万个甲基化位点，使它们成为检测癌症的无处不在的丰富的信号。Grail的靶向甲基化方法从整个基因组的大约3000万个CpG位点中，锁定并重点关注大约100万个位点CpG。Grail认为这100万个CpG位点是癌症信号检测和癌症信号来源预测的最佳组合。与WGBS相比，这允许对这些信息区域进行更深的测序，可能克服WGS或WGBS方法的预期成本和效率限制。

其次，尽管WGS在高肿瘤分数下检测到癌症，但它的检测极限比基于甲基化的方法稍差。由于其他生物学过程如衰老等，突变的靶向测序也受到个体中非常普遍的突变的影响。与其他检测方法相比，靶向甲基化方法可以检测血液中较低的癌症信号水平，与全基因组甲基化相比，无症状个体的早期癌症检测效率更高。如下图显示，靶向甲基化分析的LoD约为百万分之150（“PPM”），这明显低于评估的其他NGS方法。LoD是肿瘤分数（或cfDNA样本中肿瘤基因组的预估分数），在LoD检测限，检测到癌症的概率至少为50%。

最后，在定位癌症信号来源时，甲基化信号本质上反映了组织分化和恶性癌症状态，这使得它们比其他测试方法所带来的信息量大得多。虽然结合不同方法可以改善临床LoD并实现高于WGBS的敏感性，但显然靶向甲基化测序的单一检测更具开发价值。

这些性能（特异性、灵敏度和癌症信号起源预测准确性）在大规模临床验证研究CCGA和PATHFINDER中得到了报告，这些研究也支持了Galleri的商业推出。

性能验证

临床研究成为技术平台及所开发的产品的最终校验场。

可以说，Grail建立了基因组医学中最大的临床项目来验证其平台和产品的性能。Grail正在从9个临床研究的38.5万多名参与者那里收集临床数据，其中21,000多名参与者参与了支持Galleri开发和启动的研究，超过170,000人已注册、另有约55,000人预计将参加干预研究（NHS-Galleri和PATHFINDER 2以及首创的Galleri-Medicare真实世界研究）。

PATHFINDER是Grail完成的第一个结果返回研究，提供了关键数据，支持了Galleri的推出，并了解了临床医生如何将Galleri实施到临床实践中的护理路径中。Grail已经完成了另外五项研究的注册：NHS-Galleri、CCGA、SUMMIT、STRIVE和SYMPLIFY；正在积极注册两项研究：PATHFINDER 2和REFLECTION，并将在2024年第三季度开始注册Galleri-Medicare研究。

这些临床研究通常包括血液以及其他可用指标的收集，包括组织样本、人口统计数据、患者报告的结果数据和参与者的临床数据等。与癌症状况相关的临床信息、人口统计学和医疗数据在注册时收集，并在随访期间定期收集。Grail将这些信息与从样本测序中创建的基因组数据相结合，并利用这些数据来训练和验证Galleri测试。

PATHFINDER 2研究和NHS-Galleri试验旨在支持Galleri测试的PMA（上市前批准）提交，并选择纳入标准（匹配Galleri的预期用途人群），使用适当的检测（开发和商业上可用），并注册足够数量的参与者，以促进生成适当的数据和证据。这种设计与Grail的其他研究不同，如之前所提到的CCGA研究（该研究包括Galleri预期使用人群之外的参与者）、PATHFINDER研究（该研究注册了较少的参与者，并利用早期版本的Galleri作为初步结果）。

此外，Grail宣布了对Medicare医疗保险人口进行10万个个人真实世界研究的计划，重点是来自服务不足社区的种族和少数族裔群体以及65岁以上的老年人，将进一步评估Galleri对医疗保险受益人以及历史上服务不足社区的老年人的临床影响。

截至2024年3月31日，Grail已经出版了超过65份手稿，包括The Lancet、Nature、Nature Medicine、Cancer Cell和The Lancet Oncology等备受瞩目的期刊上。还在包括AACR、ASCO、ESMO和AAFP在内的著名医学会议上的20多个讲台和190多个海报展示了以上研究的相关数据。

产品实施

Galleri目前在Grail位于加利福尼亚州门洛帕克和北卡罗来纳州达勒姆的CAP认证和CLIA认证实验室中作为LDT提供。截至2024年3月31日，其已处理45万份临床和商业个人样本。

值得一提的是，Illumina是Galleri测试的测序仪和某些实验室试剂的主要供应商，Madison（于2023年收购了采血管制造商Streck, Inc.）是用于样品采集的管子的唯一供应商，而Twist是DNA捕获探针的唯一供应商。

Grail开发了一个完全自动化的实验室检测平台，由中央轨道系统连接的机器人工作单元组成，以提高效率并降低成本。Grail称这一可扩展的设施足以满足当前和近期需求。

由于拿到了FDA的突破性设备认定，Grail与FDA的互动已经产生了预期的提交时间表，预计在2026年上半年提交PMA。尽管如此，由于美国FDA还从未审理或批准过多癌症检测测试，需要提交哪些信息才能从FDA获得拟议预期用途的PMA，以及需要提供的数据的广度和性质都还不确定。在FDA批准并假设报销情况发生法定变化后，Grail计划寻求广泛的报销，例如通过医疗保险报销，并随后将Galleri纳入USPSTF指南建议。

Grail于2021年年中在美国推出了Galleri。截至2024年3月31日，其已经销售了18万多项商业测试，并建立了100多个商业伙伴关系，包括领先的医疗保健系统、雇主、付款人和人寿保险提供商。Grail还在预报销环境中建立了一个由10,000多名处方者组成的网络，美国各地的私人诊所都有处方者。截至2024年3月31日，Grail的商业化团队包括400多名人员，支持其多渠道战略。

Grail认为，在目前的MCED泛癌早筛市场中其占有最大份额。

但这一切才刚刚开始。

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