——真菌分子诊断技术—— “认识”真菌 真菌感染小知识 近年来真菌性疾病在很大程度上被忽视了，但随着免疫抑制或免疫调节的风险人群不断增加，再加上不可避免的真菌暴露和更灵敏的诊断方法面世，真菌性疾病将不可避免地增加。
真菌的鉴定
真菌的分类鉴定过去一般采用的是形态学方法，主要按照真菌的形态特征、生长特征、生理生化特点、抗原构造等特征加以区分，尤其是以有性态的形态特征为主要依据。目前世界上使用最广泛的真菌分类系统是Ainsworth分类系统，它按真菌孢子的类型和有性态的有无，把真菌分为鞭毛菌、接合菌、子囊菌、担子菌和半知菌5个亚门。
但真菌的种类多，形态和解剖结构复杂多变，少数形态特征和生理生化指标随着环境的变化而不稳定，且要获得其有性或无性器官需很长时间(某些真菌如半知菌亚门甚至不能形成有性态)，常会得出假阳性或假阴性结果，因此鉴定结果不是很准确。
真菌分子鉴定
近年来，随着分子生物学的发展，其在真菌分类学中发挥了越来越大的作用，其中rDNA(核糖体DNA)序列分析被广泛使用。 分子生物学技术的进步为,侵袭性真菌感染(invasive fungal infection, IFI)的诊断提供了新的思路,与传统的培养及表型鉴定相比,分子诊断技术大大缩短了诊断所需时间,同时提高了敏感性和特异性,且操作简便、易于重复。分子诊断方法大多在培养的基础上进行病原真菌分子鉴定,也有报道某些分子生物学技术可直接从液体培养瓶,甚至临床样本中进行病原检测。
聚合酶链反应- 单链构象多肽性分析(PCR2SSCP) ：应用 PCR2 SSCP技术可将曲霉鉴定到属的水平,并可一次性对烟曲霉和黄曲霉进行鉴别。 随机扩增多肽性DNA(RAPD)分析: RAPD分析是利用随机合成的单个寡核苷酸引物(8～12bp, 多为10bp) ,通过 PCR扩增靶核苷酸细胞DNA,经凝胶电泳 进行DNA片断大小及数量的多肽性分析,该法简便、易解释,便于大规模使用。 限制性片段长度多态性分析(RFLP) ：核酸限制 性内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水 解酶,其中Ⅱ型酶为通常所指的DNA限制性内切酶;酶切后 产生特异的DNA片段,经琼脂糖凝胶电泳形成酶切图谱。 mRNA 差异显示逆转录 PCR：mRNA 差异显示逆转录 PCR技术是一种在转录水平上研究基因差异表达的方法,该 方法已成为医学真菌分子生物学研究的良好工具。近年,实时定量逆转录PCR技术已成为RNA定量检测的最常用方法之一。 实时荧光定量 PCR(real2time PCR) : 实时荧光定量 PCR技术即在 PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。 巢氏PCR：如选用单拷贝基因为靶,用巢氏 PCR,其敏感性比普通 PCR要高1000倍。赵军等采用自行设 计的烟曲霉特异性引物用巢氏PCR技术快速诊断侵袭性烟曲 霉感染,在临床确诊或拟诊的侵袭性曲霉感染患者中,检测灵 敏度和特异性分别为100%和8313%。 数字PCR：一种新兴的基因检测方法，是继常规PCR、实时荧光定量PCR之后的第三代PCR基因检测 技术，数字PCR技术实现了对检测样本的绝对定量分析，具有前所未有的准确度和重现性，为快速准确地进行真菌的检测提供了崭新的技术平台。 |
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