IVD技术丨荧光定量的一管能做多少重？

    荧光定量PCR技术能做多少重取决于以下两个个因素：

• 荧光探针或荧光染料的种类和数量

    不同的荧光探针或荧光染料有不同的发射波长和荧光强度，因此需要选择合适的荧光探针或荧光染料，以避免发生荧光信号的干扰或混淆。一般来说，荧光探针或荧光染料的种类越多，一管多重的重数越高，但也越容易出现荧光信号的重叠或衰减。荧光探针或荧光染料的数量也要适当控制，以保证荧光信号的灵敏度和准确度。常用的荧光探针或荧光染料有 FAM, VIC, HEX, ROX, CY3, CY5, TAMRA, JOE, NED 等。

• 荧光检测仪的性能和设置

    荧光检测仪的性能和设置会影响荧光信号的分辨和定量。荧光检测仪的性能要求具有高灵敏度和高分辨率，以区分不同的荧光信号和测量荧光信号的强度。荧光检测仪的设置要根据荧光探针或荧光染料的发射波长和荧光强度，选择合适的激发光源和滤光片，以提高荧光信号的信噪比和准确度。常用的荧光检测仪有 ABI 7500, ABI 7900, Bio-Rad CFX96, Roche LightCycler 480 等。

探针法

使用特殊的探针，如分子信标 (molecular beacon)、双重探针 (dual probe)、双重分子信标 (dual molecular beacon) 等，每种探针对应一个目标序列，通过探针的结构变化和荧光猝灭来区分不同的目标序列。一般取决于仪器，有多少通道就做到多少减一重，一个通道留给内标，现在市场上最常见的方法，探针编码那些难以实现产业化的前沿技术在此不做介绍。

荧光探针是一种与目标序列完全互补的寡核苷酸，通常在5'端和3'端分别标记有荧光发射体和荧光猝灭体。当荧光探针与目标序列杂交时，荧光发射体和荧光猝灭体之间的距离增大，荧光发射体发出荧光信号，而荧光猝灭体不再吸收荧光发射体的能量，从而实现对目标序列的检测和定量。探针法的优点是可以实现高灵敏度和高特异性的检测，避免非特异性扩增产物的干扰，但也需要设计合适的荧光探针和优化反应条件，以保证荧光探针的稳定性和效率。

数据查询源自NMPA

溶解曲线MeltArray

使用同一颜色的荧光探针，每种探针对应一个目标序列，通过探针的溶解温度和荧光强度变化来区分不同的目标序列。

溶解曲线是一种利用荧光染料来检测和定量特定的核酸或蛋白质的分子生物学技术。荧光染料是一种可以结合到DNA双链小沟中的染料，当荧光染料与DNA结合时，荧光强度增强，当荧光染料从DNA脱落时，荧光强度减弱。通过实时监测升温过程中DNA双链的解链和荧光染料的脱落，可以得到反映荧光信号变化的溶解曲线。不同的DNA序列由于长度和GC含量的不同，会有不同的溶解温度和溶解曲线，从而实现对DNA序列的检测和定量。溶解曲线的优点是可以实现高分辨率和高通量的检测，无需使用特异性荧光探针，但也需要选择合适的荧光染料和荧光检测仪，以保证荧光信号的信噪比和准确度 。

数据查询源自NMPA

图源自第二届结核病研发合作国际论坛，MeltPro系统技术运用不对称靶标扩增，融解分析，具备多重高通量的优势，具体多重原理采用不同的荧光，不同的熔点。

使用同一颜色的荧光探针，每种探针对应一个目标序列，通过酶切后的片段长度和荧光强度变化来区分不同的目标序列。

PCR-酶切法是一种利用限制性内切酶来检测和定量特定的核酸或蛋白质的分子生物学技术。限制性内切酶是一种可以识别并切割特定的DNA序列的酶，当DNA序列中存在突变时，限制性内切酶的切割位点可能会改变或消失，从而影响限制性内切酶的切割效果。通过先进行PCR扩增，再进行限制性内切酶切割，可以得到不同的切割产物，通过凝胶电泳或荧光检测，可以实现对DNA序列的检测和定量。PCR-酶切法的优点是可以实现简单和快速的检测，无需使用荧光探针或荧光染料，但也需要选择合适的限制性内切酶和优化反应条件，以保证限制性内切酶的特异性和效率。

数据查询源自NMPA

图源自广州市宝创生物技术有限公司官网

探索

1. 圣湘的探针+溶解曲线

源自：NMPA技术审批报告公开

2.PCR酶切法+溶解曲线

荧光PCR酶切法是一种结合了实时荧光定量PCR和酶切分析的技术，用于检测DNA序列的变异或多态性。荧光PCR酶切法的原理是利用特异性的引物对目标DNA进行扩增，然后用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，根据酶切后的DNA片段的长度和数量，通过解离温度（或荧光信号）的变化来判断目标DNA的类型。

荧光PCR酶切法的步骤如下：

• 设计特异性的引物，用于扩增目标DNA序列。

• 用实时荧光定量PCR仪进行PCR反应，加入荧光探针或荧光DNA结合染料（如SYBR Green），以荧光信号积累实时监测每次PCR循环后产物总量。PCR反应的条件可以根据不同的引物和模板进行优化。

• 用限制性内切酶对PCR产物进行酶切，选择能够区分不同类型的DNA序列的酶切位点。

• 用实时荧光定量PCR仪再次进行PCR反应，检测酶切后的DNA片段的长度和数量，通过荧光信号的变化来判断目标DNA的类型。酶切后的DNA片段越短，荧光信号越弱；酶切后的DNA片段越长，荧光信号越强。不同类型的DNA序列会产生不同的酶切图谱，从而实现DNA序列的区分。

荧光PCR酶切法是一种结合了实时荧光定量PCR和酶切分析的技术，用于检测DNA序列的变异或多态性。荧光PCR酶切法的原理是利用特异性的引物对目标DNA进行扩增，然后用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，根据酶切后的DNA片段的长度和数量，通过荧光信号的变化来判断目标DNA的类型。荧光PCR酶切法的优点是反应迅速，荧光信号更强，而且具有更好的区分性和特异性，目前已用于病原体核酸检测、等位基因区分、SNP和突变检测。

综上所述，荧光定量PCR技术的一管多重的重数可以达到2-8重，利用特殊的荧光探针、荧光染料或酶切等技术组合，可以实现十余重的荧光定量PCR 。作为IVD分子领域最成熟的技平台，如利何用该平台开发新技术、解决新需求是当下解决qPCR仪库存和资源重组的一大主题。