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基因测序技术简介(上)

2023-9-19 14:50| 编辑: 归去来兮| 查看: 1800| 评论: 0|来源: 实验老司机 | 作者:林娟

摘要: 测序技术的发展推动了基因组学、生物医学研究和临床诊断的进展。

基因测序技术是一种用于确定DNA序列的方法,从最初的Sanger法测序,到后来的NGS,再到现在的单分子测序技术。

测序技术的发展推动了基因组学、生物医学研究和临床诊断的进展。

以下,我们通过3期文章,为大家介绍测序技术的来龙去脉,包括:

  • 测序技术的发展史
  • Sanger测序原理和应用
  • NGS测序原理和应用
  • 单分子测序原理和应用
  • 测序技术的应用
  • 文库构建和基因准备

1 什么是基因测序技术?
基因测序技术,即测定核酸序列的技术。
基因测序能够分析测定基因组全序列,锁定个人病变基因,预测患多种疾病的可能性,提前预防和治疗。


基因测序技术是人类探索生命奥秘的重要手段之一,最早的时候,基因测序只是应用于科研,是遗传学及分子生物学一个重要的科研工具。
但随着测序技术的发展,通过测序技术对遗传信息的解码和基因组数据库的构建,人类不仅得以窥探生命的密码,更能从基因层面对人类疾病进行检测甚至干预。
相信在基因测序技术指导下的遗传病诊治、个性化精准医疗等能够更加高效的进行,未来基因测序技术将对人类健康产生重大影响。

2 测序技术的发展历程
1977年,Sanger和Gilbert分别提出双脱氧链终止法和化学降解法,标志着第一代测序技术的诞生。
第一代测序具有长读长和准确率高的优点。但其同时也具有测序成本高、耗时久、通量低等缺点,导至其不能满足大规模基因测序的需求。
于是人们开始探究新的更高效的测序技术。


1996年,Ronaghi和Uhlen建立了焦磷酸测序,其与第一代测序技术最大的不同是边合成边测序。其最显著的特点是高通量和自动化,因而第二代测序又称高通量测序。
2005年,454Life Sciences公司基于焦磷酸测序原理推出了Genome Sequencer 20测序系统,成为二代测序的先行者。
2006年-2007年,Illumina公司和Life Technologies公司相继推出Solexa高通量测序系统和SOLiD高通量测序系统。
2009年,出现了以分子实时测序和纳米孔技术为代表的第三代测序。
第三代测序具有长读长、单分子测序的特点,但由于目前第三代测序技术因高错率仍未找到很好的解决方法,所以离临床实际应用还仍有相当长的距离。
2010年至今,各种高通量测序技术均已快速发展并逐渐成熟,随着生物科学、物理学、材料学等学科的不断发展和融合,未来的测序技术一定会向着更精准、更微观、更高通量、更廉价的方向前进。

3 Sanger双脱氧链终止法的基本原理
Sanger双脱氧链终止法是第一代测序技术中最为经典的一种。
其巧妙的利用DNA复制原理,利用ddNTP来部分代替常规的dNTP作为底物进行DNA合成反应。
在DNA合成时,一旦ddNTP参入到合成DNA链中,由于ddNTP脱氧核糖的3’-位碳原子上缺少羟基,而不能与下一位核苷酸的5’-位磷酸基之间形成3’,5’-磷酸二酯键,从而使得正在延伸的DNA链在此ddNTP处终止。



实验步骤:


1.  将待测序测序的DNA片段进行PCR扩增,得到充足的DNA模版用于进行测序。
得到的DNA模板需要进行纯化,需要确保去除所有杂质,包括DNA片段、蛋白质、RNA等。
2.  根据待测序列的特点与实验要求,设计一些特定的引物。
一般来说,通用引物的长度以15~30bp为宜。
3.  合成标记物。标记物是指示测序反应是否成功的物质,通常是一种荧光染料或放射性同位素。
4.  将DNA模板、引物、DNA聚合酶和标记物等物质混合在一起,进行测序反应。
在反应过程中,DNA聚合酶将根据DNA模板中的碱基序列合成新的DNA链,同时将标记物结合到新合成的DNA链中。
5.  将反应产物进行电泳分离,根据标记物的不同荧光信号或放射性同位素的存在,确定DNA序列中的碱基排列顺序。
在Sanger测序法的基础上,将荧光信号接收器和计算机信号分析系统替代放射自显影技术,使用荧光素标记替代32P或35S单一放射性核素标记,打开了DNA测序技术自动化的大门。


Sanger测序法的优缺点:
优点:
1.sanger是直接对DNA分子进行测序,适用于已知序列的验证测序、文库筛选、克隆鉴定、pcr重测序等。
2.其最大优点在于读取速度很高、高精确度,而且成本相对很低。相较于化学降解测序法,对于富含G-C的区域也不会影响测序效果。
缺点:
1.必须有已经序列设计测序引物,对于未知序列必须构建克隆后才能测序,难以实现基因组水平的大规模测序。
2.测定碱基序列需要大量完全相同的DNA拷贝。



文稿:林娟

校对:樊振华

素材:Canva

参考资料:

  • https://apollo-institute.org/sanger-sequencing/

  • 《基因测序技术》

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