笔者一直在关注分子诊断技术发展，分子诊断技术种类繁多，每种技术各有优劣，幻想着有没有一种技术可以全面满足临床应用的需求，最近的关注似乎有了答案。 2023年1月8日将新型冠状病毒感染从“乙类甲管”调整为“乙类乙管”，标着持续三年整的疫情基本进入尾声。新冠疫情让分子诊断技术的“核酸”检测从专业领域进入大众领域，千亿级的新冠“核酸”检测市场，也让整个领域赚的盆满钵满，当然新冠疫情也提前透支了分子诊断领域，传统的分子诊断技术在某个应用领域的发展，已经很难超越新冠病毒检测市场容量，行业已开始极度内卷。 2022年11月起达安基因体外诊断试剂产品价格进行大幅下调，一人份测试的价格为10-20元，最大降幅超过90%。大幅度的降价符合政府和民生需求，也让从事分子诊断的大量中小企业很难生存，不利于行业技术发展与创新。
荧光PCR技术具有准确性高、操作时间短、使用成本低的优势，是目前市场成熟度最高的技术，但检测把点少，产品同质化严重、内卷严重，而且经过新冠病毒的洗礼，仪器已完全下沉到县级医院，全国第三方实验室的荧光PCR仪已大量闲置，据说都不知道送给谁，已经是无人问津，荧光PCR已全面进入市场大洗牌阶段。二代测序方法具有测序数据量大的优势，但是技术门槛高、终端成本高、操作流程繁琐、需要专业人才进行数据分析和解读，适合发达城市，难以大规模普及。芯片技术因其市场容量、应用范畴和价格等已进入市场衰退阶段。核酸质谱和三代测序作为新兴的分子检测技术，处于市场导入期，两者兼具检测靶点多的优势，但二者市场应用普及率低，成熟的产品少。核酸质谱是质谱技术、芯片技术和PCR技术综合分析技术，其操作比较麻烦，数据报告时间较长（1-2天）。近期，广州达瑞的二十项遗传性耳聋基因突变检测试剂盒（飞行时间质谱法），获得了NMPA认证，核酸质谱技术应用得到落地。第三代测序技术仍处于实验室应用阶段，不过贝瑞基因率先用第三代测序技术布局了SMA检测的专利，让该技术的应用落地有了新的方向。总之，分子检测技术各有千秋，有适合多靶点检测的、有适合快速出结果的、有价格成本低的、有操作流程简单的技术。但是对分子诊断领域来说，如果有一种技术兼备价格便宜、检测速度快、准确度高、操作简单、检测靶点多等优势，必将是行业从业者及应用客户为之奋斗的目标。数字PCR技术让我们看到了众人追求目标的曙光。接下来我们从技术、国内外市场布局、NMPA注册、专家共识、国家标准和国内招标等多个角度讨论，为什么是数字PCR技术？数字PCR（Digital PCR，dPCR）是20世纪90年代末发展起来的一种核酸分子绝对定量技术。dPCR检测过程主要包括样品的分散、PCR扩增、荧光信号采集与数据分析。然后通过对反应单元总数和阳性反应单元数目进行统计，根据泊松分布公式计算出DNA 模板分子的起始浓度。与传统的荧光PCR相比，数字PCR可以精确到单个核酸分子、适合环境复杂的样本检测、无需标准曲线或参照基因对比等特点。因此，高灵敏度、绝对定量、高稳定性和较高的抗干扰能力为数字PCR技术的4大优势。数字PCR如何发展才能兼备低价、快速、精准、操作简单和多靶点检测？目前市场化的数字PCR技术完成一轮检测时间在2-4小时不等，与现有分子检测技术相比，已满足检测速度快的需求，未来数字PCR结合等温扩增技术有极大可能实现30min以内，完成一轮检测。可以更好地应用与病原体感染领域。数字PCR已经从实验室时代进入市场化时代，从操作复杂的分体机时代进入全自动一体机时代。纵观国际和国内厂家，包括伯乐、凯杰和赛默飞等国际品牌已实现数字PCR一体机市场化。国内包括思纳福、小海龟、新羿、领航已实现数字PCR一体机市场化，其中思纳福和小海龟的一体机还能同时实现自动化样本上样功能。满足分子诊断领域对操作灵活、自动化检测的需求。目前大家普遍认为限制数字PCR技术发展的主要原因是数字PCR使用成本昂贵，单个反应耗材成本从几百元到几十元不等，昂贵的耗材成本让大家望而却步。据了解，现阶段单个反应在20元-30元是大家普遍可以接受的，未来随着数字PCR市场的全面普及，相信使用成本可以达到与荧光PCR基本相同的水平。这也是数字PCR厂家为之奋斗的目标之一。近期仪器信息网、IVD资讯和分子生物应用等媒体有报道上海小海龟自建微流控芯片生产线，单个芯片耗材已迈进个位数时代，将对行业的发展起到重要的推动作用。数字PCR与荧光PCR一样，都属于PCR技术，具有相同的荧光检测方法（Taqman探针法和荧光染料法），两者均受限于荧光通道数的问题，单个反应只能实现个位数靶点检测，一般单个反应实现1-6个靶点。为了克服这一行业痛点问题，数字PCR领域的行业专家都在努力探索，并且取得了重要进展。包括前面提到的上海小海龟在布局2N指数级超多重数字PCR技术；南京普济生物在布局特殊的引物设计+体系优化的超多重技术。小海龟超多重技术基于独创的“固态油隔水”技术，利用创新的超高特异性分子诊断酶及荧光编解码技术，可实现指数级超多重检测，单个反应/芯片理论上可实现几十至上百重的靶点检测。目前布局的产品包括：1）病原体超多重检测；2）肿瘤液态活检。南京普济生物的数字PCR超多重技术，通过特殊的引物设计+体系优化，极大抑制了非特异扩增。据称目前最多实现300重检测。据了解该技术目前已经三大领域均有产品布局，包括1)肿瘤伴随诊断（结直肠癌和肺癌）；2）无创产前诊断；3）肿瘤预后监控。个人认为，数字PCR如果解决了PCR多重检测的行业痛点问题，势必用PCR的检测成本实现NGS临床应用，对二代测序技术的小panel可能会有冲击。因此，超多重数字PCR技术的出现，全面兼备价格便宜、检测速度快、准确度高、操作简单、检测靶点多等优势，必将成为分子诊断最佳技术选择。数字PCR 在肿瘤伴随诊断、食品安全和环境检测、肿瘤早筛、传染病检测、NIPT、病毒微生物分析、肿瘤研究、药物基因组学等领域具有较大临床应用潜力和优势。根据高禾投资研究中心预测，2020年至2024年中国数字PCR行业市场规模仍将保持较高增长速度，市场规模将从21.33亿元，增长至70.11亿元，年复合增长率为34.65%。国内外数字PCR技术根据其液滴化或数字化实现方式的不同主要分为微孔芯片式和油包水液滴式两大类。在油包水技术基础上发展起来的包括平铺油包水和振动油包水技术。伯乐公司作为油包水技术路线的引领者，发展了近10余年。追随其后的包括永诺、新羿、锐讯、领航、思纳福和迈克等，国内这些公司在油包水的路线上也做了大量创新与改进。目前微孔芯片技术似乎更受国际品牌的青睐，包括罗氏、赛默飞和凯杰等均选择微孔芯片技术路线，国内布局微孔芯片技术的公司包括小海龟、臻准、科维思、诺禾致源和泛生子等，其微孔芯片各有特色。数字PCR进军医疗领域的关键在于仪器、试剂盒是否获得医疗器械注册证以及专家共识。截至2023年1月，我国市场已有13家企业的数字PCR系统获得医疗器械注册证，在试剂盒审批方面，NMPA批准了南京科维思生物科技的HER2基因扩增试剂盒，新羿生物以荧光PCR法注册获得了数字PCR新冠检测试剂盒，该方法也为数字PCR试剂盒注册提供了新思路。自2019年以来，国内企业快速获批数字PCR仪器的注册证，预计从2023年开始将会陆续有数字PCR试剂盒获批医疗器械三类注册证。数字PCR在肿瘤检测、器官移植检测和病原体方向已经获得了专家认可。主要包括如下三类专家共识。外周血HER2基因扩增检测（数字PCR法）在抗HER2治疗中的应用共识，于2022年发表与《中国癌症杂志》。《中国实体器官移植手术部位感染管理专家共识（2022版）》，于2022年6月在《中华临床感染病杂志》发布。数字PCR技术被写入共识。2022年年初，发布于中华检验医学杂志《血液培养技术用于血流感染诊断临床实践专家共识》主要对血流感染诊断临床实践中的专家共识进行了阐述，内容重点提及分子诊断技术在感染诊断中的必要性，并首次将数字PCR技术作为基于血液的分子诊断技术补充单元。在国家政策方面数字PCR也得到了国家相关部门机构的认可，2022年上海小海龟的数字PCR获得了中国首张数字PCR计量评价证书，数字PCR为核酸标准物品的计量提供了保障。另外，公开网站检索发现数字PCR已获得3项国家级标准；团体、行业和地方标准共计35余项。充分说明国家对数字PCR技术的认可与肯定。全国公开招投标结果显示自2013年开始，数字PCR年中标数从个位数时代进入年中标量过百，尤其是2021和2022两年，数字PCR每年中标数超过300余套，从高校科研院所、海关、疾控、医院等各大领域均在布局数字PCR。除了以上政府招标部门外，工业领域包括分子诊断领域、计量定值和生物制药等领域，更是数字PCR技术的青睐者，预计工业客户每年采购的数字PCR不低于政府招标采购领域。因此数字PCR已成为国家和全行业认可与肯定的技术，未来发展空间巨大。综上所述，数字PCR在技术层面全面满足价格便宜、检测速度快、准确度高、操作简单、检测靶点多的临床需求。在应用层面有专业领域专家共识、NMPA批准的仪器与试剂盒注册证及国家标准等。国家认可，国际知名品牌和国内上市公司对数字PCR的布局更增强了行业对数字PCR的信心。因此，数字PCR极有可能引领分子诊断未来10年黄金期的发展，成为分子诊断行业的新一代宠儿。
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