预发表｜世界卫生组织《应用新一代靶向测序技术检测耐药结核病：快速通告，2023》解读 ...

高通量测序技术泛指二代测序技术和三代测序技术，也被统称为新一代测序技术（next generation sequencing，NGS）。依据检测策略的不同，高通量测序方法主要分为靶向测序（targeted NGS，tNGS）、宏基因组（metagenomics NGS，mNGS），以及全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）。tNGS先通过靶向捕获特定基因后再进行高通量测序，具有能同时平行检测多个靶基因的特点，近期在结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）耐药基因检测领域开始被应用。2023年7月，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）发布了《应用新一代靶向测序技术检测耐药结核病：快速通告，2023》，在tNGS技术全球应用尚处于起步阶段的背景下，足以体现WHO对新一代tNGS技术在耐药结核病诊断中应用前景的认可和高度重视。WHO希望在有关tNGS在耐药结核病诊断中应用的更为详细的数据正式公布之前，提前向全球分享此次对该项技术分析后的主要发现和结论，以提高结核病防控领域对tNGS技术检测MTB耐药应用价值的认识，从而推动该新技术的合理应用和推广。

2022年，WHO组织专家对商业化的以诊断耐药结核病为目标的tGNS技术的已发表和待发表的数据进行荟萃分析。专家组以临床标本处理作为关注的起点，以检测报告作为结果评价的对象，对耐药基因突变的解读以WHO的MTB标准基因突变目录作为参考依据，对tGNS技术的诊断准确性、成本效益，以及检测的可行性、可接受性、公平性和用户评价等进行综合分析。WHO专门成立了指南制定小组（Guideline Development Group，GDG），在2023年5月召开会议，对荟萃分析结果进行讨论并形成推荐意见。本版快速通告发布的目的是为向国家级结核病防治规划实施者及其他利益相关方分享WHO对tNGS技术诊断耐药结核病数据分析后的主要发现和观点，更为详细的数据和建议将在晚些时候发布的《WHO结核病整合指南模块3：诊断——结核病的快速诊断（2023年修订版）》中发布。

虽然耐药分子诊断技术不断问世，普及程度逐步提高，但常用分子检测技术的缺陷也日益显现。目前主流的分子诊断技术产品主要针对特定药物的靶基因进行检测，虽然技术的可靠性已被广泛认可，但对于尚没有建立相应检测方法的抗结核药物，在化疗方案中选用这些药物仍具有盲目性。考虑到耐药的实际发生情况，不管是针对敏感结核病的化疗方案还是耐药结核病化疗方案，均存在选药不当的风险。即便是抗结核新药如贝达喹啉、利奈唑胺和普托马尼，随着应用的增多必然带来耐药发生的风险。在WHO推荐的快检诊断技术中，有的技术能迅速检测出利福平耐药，但由于缺乏对应的技术快速检测细菌是否对异烟肼耐药，因此无法快速判断患者是否患有耐多药结核病，由此诞生了“利福平耐药”这一耐药定义。利福平耐药的定义属于权宜之计，反映了对其他药物快速耐药诊断能力的不足。据估计，临床利福平敏感但异烟肼耐药的结核病患者数是利福平耐药患者数的2倍，而全球耐多药/利福平耐药结核病患者中，氟喹诺酮类药物耐药率约为20%，但由于缺乏适宜的快速检测技术，不能及时发现这些耐药患者。因此，对于耐多药/利福平耐药结核病患者，不能避免对其仍然采用相应药物治疗。此外，针对耐多药/利福平耐药结核病已经建立了多种强有力的化疗方案，如BPaLM（B：贝达喹啉，Pa：普托马尼，L：利奈唑胺，M：莫西沙星）方案，其所包含的贝达喹啉和利奈唑胺是该方案中的核心药物，如果核心药物发生耐药会导至治疗失败，因此，也需要建立针对新型抗结核药物的耐药检测方法。总之，为提高药物敏感结核病和耐药结核病的治疗成功率，亟待建立能够实现对抗结核治疗方案中所有被包含药物的耐药检测技术。在上述背景下，能够一次检测多达几十个靶标的tNGS技术在耐药结核病领域的应用受到了高度关注。

1、tNGS 检测MTB耐药具有常规分子检测技术不具备的优势

tNGS技术可以纳入多种药物的耐药基因作为检测靶标，单一的一次检测即可实现对多达十余种的抗结核药物的药物敏感性进行判断，上述药物既可包括常规的抗结核药物，也包括各种新型抗结核药物；检测可直接应用于临床标本，并可在收到标本后当天或几天内报告结果；易于根据抗结核药物耐药机制研究的进展扩展纳入耐药相关的新基因靶标；能够给出各种基因突变的具体类型，有助于区分同一基因中不同突变类型导至的不同程度的耐药。

鉴于tNGS技术在靶基因数量和突变类型检测方面强大的优势，且用时较短，因此，技术具有良好的应用前景。目前关于tNGS技术临床应用的数据还比较少，但已展现出符合预期的表现，结果可靠，一次即可获得十余种药物的耐药基因突变情况。未来随着技术的日臻完善，每例病原学阳性的结核病患者都可以在就医后的短时间内获得可用抗结核药物完整的耐药谱，指导针对个体的精准化疗方案的制定，将会对提高结核病治愈率有立竿见影的效果，并由此缩短患者排菌时间，减少疾病传播。

2、tNGS技术检测MTB耐药性具有良好的可靠性

荟萃分析显示，tNGS检测呼吸道标本诊断耐药结核病具有很高的敏感度和特异度。在病原学确诊的肺结核患者中，tNGS检测利福平、异烟肼、莫西沙星及乙胺丁醇耐药性的合并敏感度均≥95%，检测左氧氟沙星和吡嗪酰胺耐药性的合并敏感度分别为94%和88%，而tNGS检测耐药性的特异度在所有药物中均≥96%。在病原学确诊的利福平耐药结核病患者中，tNGS检测异烟肼、左氧氟沙星、莫西沙星、吡嗪酰胺及乙胺丁醇耐药的合并敏感度均≥95%，而对贝达喹啉（68%）、利奈唑胺（69%）、氯法齐明（70%）、阿米卡星（87%）和吡嗪酰胺（90%）耐药检测的敏感性偏低，但准确性仍在可接受范围内；除链霉素（75%）以外，tNGS检测其他所有抗结核药物耐药性的特异度均≥95%。

对于大多数常用抗结核药物，tNGS技术检测耐药的敏感度和特异度不低于现有的已被广泛认可的表型药物敏感性试验（简称“表型药敏试验”）或耐药分子检测技术，表明其已满足了临床应用的性能要求。一些相对较新的抗结核药物的耐药检测的敏感度虽不十分理想，但特异度很高，因此，对于这些药物tNGS技术诊断耐药的可靠性很好，但会出现耐药患者漏检。一些药物耐药检测的性能指标较低，一方面可能是作为对照方法的表型药敏试验自身在可重复性和准确性方面存在不足，以乙胺丁醇和吡嗪酰胺最为突出。另一方面，一些新型抗结核药物还未能建立公认可靠的表型药敏试验方法，也缺乏对耐药机制的全面了解，导至耐药相关基因的发现不足，如利奈唑胺、贝达喹啉、氯法齐明等，由此造成很多体外药敏试验显示耐药程度较高的菌株并未发现存在已知耐药基因的突变。因此，对于上述新药，其tNGS检测性能的提高有赖于后续研究的进展。此外，当临床标本中MTB载量较低时，容易出现表型药敏试验和分子检测结果不一致的情况。NGS技术可发现菌群中含量非常低的基因突变，但非常少量的耐药菌是否会发展成真正耐药还有待更多研究证实。

3、开展tNGS检测MTB耐药在某些应用场景下符合成本效益

WHO挑选了3个结核病流行程度不同的国家（包括格鲁吉亚、印度和南非）开展tNGS检测MTB耐药的成本效益的模型分析。tNGS检测成本中以试剂和耗材占比最高。格鲁吉亚作为一个高耐多药/利福平耐药结核病负担国家，如果将tNGS作为所有经病原学确诊结核病患者的初始耐药检测的方法，只有在支付意愿（willingness-to-pay，WTP）阈值3倍于该国人均国民生产总值的情况下才符合成本效益。当在上述3个国家所有的利福平耐药结核病患者中以tNGS技术取代表型药敏试验时，在印度无论WTP阈值高低，tNGS检测MTB耐药均符合成本效益；南非只有在3倍于WTP阈值时才符合成本效益；而在格鲁吉亚tNGS检测MTB耐药则完全不符合成本效益。当tNGS技术同时检测多种病原体或结核病患者数量很多时，更倾向于符合成本效益，如果考虑开展tNGS检测会使有效治疗方案的实施提前，则成本效益会明显增加。

目前，tNGS还属于一项价格昂贵的检测技术，因此，在上述分析中显示仅特定场景下的应用符合成本效益。正如其他新技术的推广使用过程一样，随着tNGS技术应用的铺开，越来越多的企业会参与到tNGS产品研发与注册中，检测产品的性能将不断优化，试剂和耗材的成本也会随着检测数量的大幅增加而逐步降低。因此，未来tNGS技术检测MTB耐药将越来越符合成本效益，并能够适用于更多的应用场景。此外，在WHO的上述分析中，并未将tNGS检测缩短耐药诊断延误、减少抗耐药结核病治疗启动的延迟纳入分析，因此，tNGS检测实际的成本效益应该会更好。

4、技术人员对tNGS检测MTB耐药的技术接受程度高

WHO委托相关人员对直接操作tNGS的检验技术人员和管理人员及结核病诊疗领域的国际专家进行了访谈（共17位受访者），对tNGS操作的接受程度进行了定量分析，发现受访人员对tNGS技术接受度高，并非常看好技术的应用前景，普遍认为其是MTB耐药检测领域的一个“重大的进步”。受访人员认可的tNGS优点包括能直接应用于临床标本、同时对多种药物进行耐药检测、时间快速（3～5 d），但存在技术操作复杂、需要专用设施和设备、对操作人员要求高等缺点。此外，受访人员还认可，设备安装、人员培训、可靠的物流、高效准确的数据管理、数据存储，以及稳定的网络连接等将会对技术推广带来挑战，因此，认为tNGS技术目前更适于在中心实验室/中心检验机构开展。

目前，tNGS技术的优点和缺点都非常鲜明，但由于其优点非常突出，一定程度上使其缺点也能够被技术人员所接受。应该看到，技术现有的缺点正是未来tNGS技术优化的研究方向。体外诊断技术的发展方向是床旁检测技术，即现场快速检验（point-of-care testing，POCT），提高tNGS技术操作的全自动化程度，增加数据分析的简便性，不断降低设备和试剂耗材的价格，减少对设施的要求，将是tNGS真正走向临床应用，甚至未来替代传统药敏试验和分子检测的必经之路。

5、目前符合WHO诊断性能标准的tNGS产品及其覆盖的药物

荟萃分析主要关注了不同厂家tNGS产品相关的已发表或尚未发表的数据，并由此确定了符合WHO对结核病耐药分子检测要求的产品清单：

（1）Deeplex®️Myc-TB（法国GenoScreen公司）：适合开展利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氟喹诺酮类药物、贝达喹啉、利奈唑胺、氯法齐明、阿米卡星及链霉素的耐药检测。

（2）NanoTB®️（英国Oxford Nanopore Technologies公司）：适合开展利福平、异烟肼、氟喹诺酮类药物、利奈唑胺、阿米卡星及链霉素的耐药检测。

（3）TBseq®️（杭州圣庭医疗科技有限公司）：适合开展乙胺丁醇耐药检测。

上述推荐仅参考了已公开发表的数据或是能够获得的相关数据，在此基础上形成了对特定产品的推荐，对未纳入数据进行分析的产品无法客观评判。我国在MTB耐药检测tNGS技术研发方面处于世界的前沿，多家公司的产品已通过第三方实验室的方式应用于临床，为临床诊疗提供了重要参考依据。目前国内的tNGS产品正处于不断提高检测性能和自动化水平，降低成本，增加检测靶标的产品完善阶段，相信未来在此领域国产产品也能够大放异彩。

现有证据支持对确诊的结核病患者采用tNGS技术进行快速诊断耐药，以为结核病治疗方案的制定提供更全面的耐药谱，提高化疗方案制定的精准性。然而，目前tNGS技术还不能完全取代现有耐药分子检测技术，尤其是一些快速、简易、经济的分子检测技术，如WHO推荐的快检诊断技术，目前仍然具备良好的临床应用价值。tNGS技术能在短时间内获得多种药物敏感性信息的强大优势，决定了其将成为未来MTB耐药分子诊断产品研发的重要方向，而其可靠性和实用性的提高取决于MTB对抗结核药物耐药机制研究的不断进步，以及产品检测性能的不断优化。

参考文献（略）

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编辑：李敬文

审校：郭   萌

发布日期：2023年9月1日