荧光侧向层析检测试剂由原材料和辅料两大部分组成。其中，原材料主要包括固相层析膜、抗原/抗体以及信号示踪物三大组分。图1是荧光侧向层析试剂的技术概览图，我们想要提升或优化试剂性能，可以从这张图上的每个分支点去定点攻克，从点到面，再到试剂的整体。今天，我们以双抗体夹心法为例，从原料选择和工艺优化两方面入手，选取了三个讨论点，包括抗体的偶联工艺优化，引入信号放大体系（生物素-链霉亲和素系统），以及关键原材料的选择（抗体和微球），结合实际案例展开探讨。
荧光微球作为试剂的主要原料，对于试剂性能起着至关重要的作用。因此，荧光微球的偶联便成为了我们提升试剂性能的关键切入点之一。
羧基微球偶联抗体根据其原理和步骤的不同可分为一步法两步法。如图2、3所示，我们通过对一步法和两步法工艺步骤进行详细分解，锁定了两种偶联工艺的不同点，并总结出具体工艺步骤中的注意事项。
简而言之，在一步法中，活化和偶联在同一反应体系中，反应生产EDC-中间酯；而在两步法中，先活化，形成NHS-中间酯，并通过清洗步骤将过量的EDC和NHS清洗后，再进行偶联反应。
以肌钙蛋白I试剂为例（如图4所示），我们在肌钙蛋白原型试剂开发时，发现两步法相较于一步法有更低的本底，同时有更高的信噪比，尤其在检测低值样本时，两步法试剂的样本区分度更好。因此，可根据具体项目进行工艺的选择和优化，以达到更高的试剂性能。
试剂条的设计和反应系统的选择是试剂性能的基石，直接决定了试剂条性能和可优化空间。以常规的双抗体夹心法为例，一般是在NC膜上包被捕获抗体，在结合垫上喷涂标记抗体和微球的偶联复合物，在不改变抗体的前提下，如果想要在这个反应系统上大幅度地提升试剂灵敏度，可优化的点和面都是比较有限的，很难进行大刀阔斧的改变，容易被束缚手脚。但是如果我们引入生物素-链霉亲和素体系，其高亲和力、多价结合能力以及不同使用方法则为试剂性能的提升提供了更多的可能性和更大的空间。
图5的表格中，我们总结了荧光侧向层析试剂常见的三种反应系统，分别为常规双抗体夹心法体系即反应系统-1，生物素-链霉亲和素体系即反应系统-2，以及采用预制SA-微球的反应系统-3。根据试剂条的组分分析，总结了三种反应系统的特点和区别。
图6 肌钙蛋白I试剂开发中引入生物素-链霉亲和素系统（校准品检测）
如图6所示，我们在肌钙蛋白原型试剂开发时，对图5所述的三种反应系统进行了评估和比较。在校准品检测中，反应系统-2显示出了远高于其他两种方法的信噪比优势。
图7 肌钙蛋白I试剂开发中引入生物素-链霉亲和素系统（样本检测）
在样本检测中（图7），反应系统-2也表现出了较好的相关性和信噪比，相较于常规的反应系统-1，其信噪比有1.2~2倍的提高。因此，通过尝试不同的反应体系，尤其是引入生物素-链霉亲和素系统，可以作为试剂优化的重点方向
关于关键原材料的选择与优化，我们将分别从抗体选择搭配、抗体活性和微球粒径选择三个方面出发并结合实例跟大家进行讨论和分享。
如图8所示，在面对诸如肌钙蛋白I之类在外周血中有多种存在形式，并且受多种干扰因素的影响的标志物而言，抗体的选择与搭配对于试剂的性能影响至关重要。
图9 肌钙蛋白I试剂开发中的1+1与2+1模式比较（校准品）
由于肌钙蛋白生化性质非常复杂，我们针对肌钙蛋白I的生化特性，评估了抗体的1+1，2+1和2+2配对及组合模式。可以看出，无论是在校准品检测还是样本检测中，2+1模式比1+1模式具有更高的灵敏度，且2+1模式有更好的相关性。因此，为了进一步提升试剂的性能，更换抗体搭配组合可能会发挥重要作用。
图10 肌钙蛋白I试剂开发中的1+1与2+1模式比较（样本）
在2+1模式中仍有部分样本检测偏低的现象，说明还有干扰因素没有被完全规避，提示我们增加补位抗体以提高试剂的检出能力。
图11 肌钙蛋白I试剂开发中的2+1和2+2模式比较
因此，我们在2+1模式的基础上升级为2+2模式。无论是检测相关性还是灵敏度，2+2模式均表现出优势。更重要的是，之前在2+1模式中漏检的三例样本，在2+2模式中得到了检出，并与靶值非常接近。
我们在筛选抗体时，会倾向于优选活性较高的抗体，但在具体实践中，我们也发现了由于抗体活性过高而对试剂性能带来的负面影响，如本底高，线性范围窄等现象，这时候我们就需要一些方法和处理去降低抗体的活性，并在本底、线性范围及样本相关性方面去做一些选择和平衡。
图12 NT-proBNP试剂开发中抗体标记活性过高
在NT-proBNP试剂开发中，我们的NT-45这一株抗体表现出了过高的标记活性，在未优化的原型试剂中表现除了本底高、线性范围窄以及相关性不佳的现象（图12）。这时，我们对原型试剂进行了一系列的优化和调整。
图13 NT-proBNP试剂开发中降低抗体与微球的标记比例
图13所示的思路1是通过降低抗体与微球的标记比例，以降低标记活性。据此，我们也取得了较好的结果，校准曲线的斜率降低，样本的相关性得到提升。
图14 NT-proBNP试剂开发中加入无关蛋白或其他物质降低抗体标记效率
图14所示的思路2是通过在标记体系中加入无关蛋白以竞争微球的活性结合位点，这一方法与思路1取得了类似的效果，校准曲线的斜率降低，样本的相关性得到提升。
因此，当我们遇到高亲和力的抗体时，可以针对性地分析问题，并尝试不同的方法去降低其标记活性以改善试剂性能。这个时候，我们反倒会有一举多得的效果，例如，当我们降低抗体用量时，高亲和力的抗体仍旧可以提供良好的灵敏度和特异性，那其实达到降低了试剂的生产成本的效果。
图15 NT-proBNP试剂开发中微球粒径的选择
除了抗体，关键原材料中的微球的选择也与试剂性能密切相关。如图15所示，以300 nm和200 nm微球为例，两种不同粒径的微球在NT-proBNP试剂中表现出了不同的信号强度和校准曲线斜率。200 nm微球有更平缓的校准曲线，因此对于案例4中的活性过高的标记抗体，还可以选用200 nm微球以降低校准曲线的斜率。
图16 PCT试剂开发中不同粒径微球的混合使用（校准品）
此外，在试剂开发中，我们还可以采用不同粒径微球混合使用的策略。我们在PCT原型试剂开发中，将200 nm和300 nm微球混合使用，在校准品检测中（图16），达到了拓宽线性范围的效果。
图17 PCT试剂开发中不同粒径微球的混合使用（样本）
在样本检测中（图17），由于线性范围的拓宽，高值样本得到了较好的赋值和回归，因此混合粒径试剂的相关性也优于单一粒径试剂。
此文中，我们分别从偶联工艺的选择与优化、反应系统的选择与优化、关键原材料的选择与优化三大方面，结合具体实例，总结了一些优化方向并提出了相关建议，希望能够给大家提供一些思路和启示，以期为大家的试剂开发工作添枝加叶。
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