IVD研发视角｜剖析SpotFire技术

图源自BioMérieux公司官网

BioFire SpotFire呼吸道（R）检测板的样本类型是鼻咽拭子，放在1-3 mL的病毒运输介质中，操作时间为1-2分钟，结果时间约为15分钟。BioFire SpotFire呼吸道（R）检测板可以检测以下15种靶标，包括病毒类：腺病毒、冠状病毒SARS-CoV-2、冠状病毒（季节性）、人类冠状病毒、人类鼻病毒/肠道病毒、甲型流感病毒、甲型流感病毒A/H1-2009、甲型流感病毒A/H3、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒；细菌类：副百日咳博德特氏菌、百日咳博德特氏菌、肺炎衣原体、肺炎支原体。

BIOFIRE SPOTFIRE仪器是一种紧凑、灵活、易用的分子诊断平台，可以根据不同的检测需求进行垂直堆叠，最多可连接四个模块，每个模块可同时运行一个测试。该仪器具有直观的系统界面和简化的工作流程，可以由任何医护人员在任何医疗场所使用。该仪器还可以无缝地与点护数据管理系统和其他兼容的系统和软件进行连接。

BioFire SpotFire运行BioFire SpotFire呼吸道（R）检测板，这是一种用于同时检测和鉴定疑似患有COVID-19或其他呼吸道感染的个体样本中的多种呼吸道病毒和细菌感染的体外诊断试剂。该系统具有以下特点：

• 占用最小的台面空间，可以垂直扩展到四个模块，实现可定制的吞吐量；

• 模块随机访问允许同时运行多达4个测试；

• 易于使用，具有直观的系统界面和简化的工作流程；

• 可以由任何医疗专业人员在任何医疗环境中使用；

• 无缝连接点护理数据管理系统和其他兼容的系统和软件。

信息查阅

根据BioMérieux公司官网介绍和FDA 510(k)披露的信息，BIOFIRE® SPOTFIRE® System及其BIOFIRE® SPOTFIRE® Respiratory (R) Panel允许医疗保健专业人员在大约15分钟内为怀疑呼吸道感染的患者提供结果。除了速度之外，BIOFIRE SPOTFIRE®® R Panel还可以检测呼吸道感染背后的15种不同的细菌，病毒和病毒亚型，包括SARS-CoV-2，甲型和乙型流感以及RSV。同时SpotFire是第一个也是唯一一个获得FDA批准和CLIA豁免的SARS-CoV-2和其他14种呼吸道病原体的诊断平台。正如新冠大流行所表明的那样，尽可能靠近患者的快速、准确和易于使用的诊断具有巨大的临床价值——CLIA 免除了支持。有史以来第一次，临床医生在大约 15 分钟内在他们的诊所中，就在患者旁边，拥有核心实验室质量多重测试的能力。SpotFire仪器使用美国专利Nos.9932634和10144960，BIOFIRE® SPOTFIRE® Respiratory (R) Panel使用美国专利Nos.9932634和11021744。生物梅里埃拥有这些专利的专有权，PCR的每个循环可在10秒内完成。根据FDA的报告，BioFire SpotFire呼吸道（R）检测盒的敏感性和特异性分别为98.7%和99.9%。

专利简读

专利US9932634B2，该专利被32项其他专利引用，并有25项专利引文和71项非专利引文。于2018年4月3日授予犹他大学研究基金会。发明人是Carl T. Wittwer和Jared Steven Farrar。该专利主张一种通过使用高浓度的引物和聚合酶，并在变性温度和延伸温度之间对样品进行热循环的方法，使用极端温度循环曲线，每个循环在20秒内完成，从而扩增生物样品中的目标核酸序列。该专利还提供了一些关于聚合酶链反应（PCR）技术及其这是一项关于快速核酸扩增的方法，它通过增加引物和聚合酶的浓度来提高扩增效率。这项专利于2013年5月23日申请，2018年4月3日授权，有效期至2034年10月3日。

专利中提到一对特异性结合于目标DNA序列的短寡核苷酸，用于在PCR反应中引导DNA聚合酶的延伸。引物的长度一般为15-30个碱基，其浓度在该发明中高于0.5 μM。专利中提到一种能够催化DNA链增长的酶，用于在PCR反应中复制目标DNA序列。聚合酶一般为热稳定的，能够在高温下保持活性。聚合酶的种类有多种，例如Taq、Pfu、Bst等，其浓度在该发明中高于0.05 U/μL。将反应容器放入快速循环PCR仪中，进行PCR扩增。PCR循环包括以下步骤：（a）在94°C至99°C之间的温度下进行DNA变性，持续时间为0.5秒至10秒；（b）在40°C至70°C之间的温度下进行引物退火，持续时间为0.5秒至10秒；（c）在60°C至75°C之间的温度下进行DNA延伸，持续时间为0.5秒至10秒。重复这些步骤直到达到所需的扩增水平。

这个专利的创新点是提出了一种“极端PCR”的方法，它可以在10分钟内完成30个循环，每个循环小于20秒。这种方法通过增加引物和聚合酶的浓度，以及优化温度控制和循环时间，来实现快速扩增目标核酸序列。这种方法可以用于检测各种生物样本中的基因变异、病原体、遗传疾病等。这个专利还提供了一种用于执行极端PCR的装置，它包括一个用于容纳PCR样本的样品容器，一个用于加热样本的加热装置，一个用于冷却样本的冷却装置，以及一个用于控制样品容器在加热装置和冷却装置之间重复移动以实现热循环的控制装置。这种装置可以实现高达200°C/s的温度变化速率，并且可以实时监测样本的温度和扩增情况。这个专利还提供了一种用于执行极端PCR的试剂盒，它包括dNTPs、聚合酶和一对用于放大目标核酸的引物，其中聚合酶至少提供0.5μM的浓度，引物各自至少提供2μM的浓度。

Extreme PCR

这篇论文的主要内容是介绍了极端PCR技术的详细信息，它可以在15-60秒内高效、特异地扩增人类基因组中的特定DNA片段。PCR所需的时间与关键反应物的浓度成反比，因此提高引物和聚合酶的浓度并缩短温度循环的时间可能会加速PCR过程。笔者面对该参数设计时考虑非特异性扩增来解决产品问题，大佬已经通过该方法来缩短时间问题。极端PCR的原理是通过提高引物和聚合酶的浓度10-20倍，使其与快速的温度循环（0.4-2.0秒）相匹配，从而加速引物退火和聚合酶延伸的动力学过程。作者使用了特制的仪器，可以在62°C-76°C的退火/延伸温度和85°C-92°C的变性温度下，对1-5微升的样品进行0.4-2.0秒的温度循环。作者用琼脂糖凝胶和高分辨率熔解分析来评估扩增的特异性和产量，并用实时光学监测来证明扩增效率和分析灵敏度。结果显示，使用人类基因组DNA中的单拷贝基因，可以在15-60秒内扩增45-102 bp的靶标。琼脂糖凝胶显示出预期大小的明亮单带，高分辨率熔解曲线显示出单一的产物，而不需要使用任何“热启动”技术。扩增效率为91.7%-95.8%，使用0.8-1.9秒的循环，具有单分子灵敏度。一个60 bp的基因组靶标可以在14.7秒内用35个循环扩增。作者得出结论，PCR所需的时间与关键反应物的浓度成反比。通过将引物和聚合酶的浓度提高10-20倍，并使用0.4-2.0秒的温度循环，可以在<15秒内从人类DNA中进行高效（>90%）、特异、高产量的PCR。极端PCR展示了在感染性疾病、法医学和任何需要即时结果的应用中进行等待式检测的可行性。

引用：

1. 生物梅里埃官网BIOFIRE® SPOTFIRE System Respiratory Panel | BioFire Diagnostics.

2. US9932634B2 - Methods for fast nucleic acid amplification - Patents.

3. Jared S Farrar, Carl T Wittwer, Extreme PCR: Efficient and Specific DNA Amplification in 15–60 Seconds, Clinical Chemistry, Volume 61, Issue 1, 1 January 2015, Pages 145–153.