分子｜什么是RT-PCR的基线？

大家好，今天我们来讨论一下什么是RT-PCR的基线，先看下图。

这是一个相当标准的RT-PCR扩增图，我们可以看到一些漂亮的曲线，每条曲线都有熟悉的指数增长期、线性增长期和平台期。但是，在早期循环当中，我们看到的线条是杂乱无章的，这些对我们的检测并没有用处，它属于，也就是我们常说的，噪音。

‘噪音’是在实际信号放大到足以克服这些背景杂音之前，设备所采集到的相关信号值，它对我们的检测结果是完全没有用处的，但这并不意味着我们可以无视它。

噪音对于PCR曲线是有影响的，所以，我们需要有效的减去噪音来减少这种，正是处于这个目的，基线被设立了。

基线实际上是一个周期间的范围，这个范围处于扩增曲线出现前，在那个阶段，只有噪声可以被看到。一旦基线建立，PCR软件就可以有效地减去噪音，从而大大改善数据质量。

现在，让我们把Y轴换成线性刻度，从而说明基线减去的效果。

这是在进行基线处理之前的数据。请注意，每个样本在Y轴上的起点略有不同，这导至这些样本的几何相位数据，也就是红框的位置，在线性比例中难以获得区分，或者难以合并，数据质量不高。

但是，一旦我们减去噪音，那么每个样本都从相同的零点开始，结果，数据就变得干净了许多。

对背景进行归一化处理后得到的数值被称为ΔRn。如果仔细观察对数比例的扩增曲线，你就会发现，ΔRn就是图形上的Y轴值。

在RT-PCR软件中，有两种设置基线的方法，手动和自动模式。

如果用手动方式，我们将会在分析设置下设置基线范围，同时也可以为单个检测项目设置。在这种情况下，该检测项目的所有孔都会减去相同的基线值。

当然，我们可以在高级设置下单独设置每个孔的基线值。

另一种方法是是使用默认的自动基线设置。选择了这个选项，软件会自动计算出每个孔需要减去多少噪音，这一般会产生最好的结果。

现在问题来了了，既然自动模式这么强大，为什么要有一个手动功能呢？这主要是因为自动功能有时会失败，特别是在一些SYBR检测和非标准化学检测中。

我们可以通过曲线的形状知道自动模式发生了故障。如果它们看起来更像s型，那可能是自动系统错误地提供了基线，并将结束周期设置得很低，所以并没有减去足够的噪音，从而导至曲线呈现出奇怪的形状。

要解决这个问题，请将该检测项目切换到手动模式，并提高结束周期，直到曲线呈现正常形状。

好了，关于基线的话题，我们就谈到这里，希望能对大家有所帮助。