技术｜一文读懂第二代测序

在过去的56年里，研究人员一直在开发方法和技术，以协助确定生物样本中的核酸序列。我们对DNA和RNA进行准确测序的能力对许多研究领域产生了巨大影响。本文讨论了什么是第二代测序（NGS），该技术的进展和它的应用。

1953年，沃森和克里克在罗莎琳-富兰克林的DNA晶体学和X射线衍射基础工作的基础上确定了DNA的结构[1,2]。然而，第一个被测序的分子实际上是RNA--tRNA--在1965年由Robert Holley和后来的噬菌体MS2的RNA[3,4]。随后，各个研究小组开始将这些方法用于DNA测序，1977年Fredrick Sanger及其同事取得了突破性进展，开发了链式终止法[5]。到1986年，第一个自动化的DNA测序方法已经被开发出来[6,7]。这是测序平台发展和完善的黄金时代的开始，包括关键的毛细管DNA测序仪。

链式终止法，也被称为Sanger测序法，使用感兴趣的DNA序列作为PCR的模板，在延伸步骤中向DNA链添加修饰的核苷酸，称为双脱氧核苷酸（ddNTPs）[8]。当DNA聚合酶加入一个ddNTP时，延伸停止，导至产生无数的DNA序列的拷贝，所有长度都跨越了扩增片段。然后，在早期方法中使用凝胶电泳对这些链端寡核苷酸进行大小分离，或在后来的自动毛细管测序仪中使用毛细管进行分离，并确定DNA序列。随着这些巨大的技术进步，人类基因组计划于2003年完成[9]。2005年，第一个商业化的NGS平台，或已经成为第二代（2G）的平台问世，与桑格测序相比，能够以大规模并行的方式扩增特定DNA片段的数百万份[10]。

Sanger测序和2G NGS的关键原理有一些相似之处[11,12]。在2G NGS中，遗传物质（DNA或RNA）被分割开来，通过一个被称为适配序列连接的步骤，已知序列的寡核苷酸被连接在上面，使这些片段能够与选择的测序系统相互作用。然后，每个片段的碱基通过其发射的信号被识别出来。Sanger测序和2G NGS之间的主要区别来自于测序量，NGS允许并行处理数百万个反应，从而实现高通量、更高的灵敏度、速度和降低成本。大量的基因组测序项目，用Sanger测序方法需要很多年，现在用NGS可以在几小时内完成。

NGS技术有两种主要的方法，即短读和长读测序，每种方法都有自己的优势和局限性（表1）[13]。投资发展NGS的主要范围是它在临床和研究环境中的广泛适用性。在临床上，NGS通过鉴定种系或体细胞突变，被用来诊断各种疾病[14,15]。在临床实践中向NGS转变的理由是该技术的力量和持续下降的成本。NGS也是元基因组研究中的一个有价值的工具，用于传染病的诊断、监测和管理[16,17]。2020年，NGS方法在确定SARS-CoV-2基因组的特征方面发挥了关键作用，并在监测COVID-19大流行方面不断作出贡献[18,19]。

图1 | 测序方法学的演变

时间轴（X轴）表示第一代、第二代和第三代测序技术的引进，对照每台机器每天可测序的DNA千碱基数量（Y轴）。

NGS一词通常被认为是指2G技术，然而，第三（3G）代和第四（4G）代技术后来也发展起来，它们的工作原理不同。

2.1、测序平台/测序技术

第二代测序方法是成熟的，有许多共同的特点。然而，它们可以根据其基本的检测化学原理进行细分，包括连接测序（结合纳米球）和合成测序（SBS），后者进一步分为质子检测、火法测序和可逆终止器（图2）。

图2 | 代表2G测序平台的原理和不同化学方法的工作原理的图。

质子检测测序依赖于计算DNA聚合过程中释放的氢离子。与其他技术不同，它不使用荧光，也不使用改性核苷酸或光学。相反，pH值的变化是由半导体传感器芯片检测的，并转换成数字信息[20]。

火法测序利用检测焦磷酸的生成和光的释放来确定特定的碱基是否已被纳入DNA链中[21,22]。

到目前为止，最流行的SBS方法是利用‘桥式扩增’的可逆终止测序。在合成反应中，片段与流动池上的寡核苷酸结合，从序列的一侧（流动池上的P5寡核苷酸）到另一侧（P7）形成一个桥梁，然后进行扩增。添加的荧光标记的核苷酸用直接成像法检测[23]。

与SBS不同，连接测序不使用DNA聚合酶来创造第二条链。而是利用DNA连接酶对碱基配对错配的敏感性，用产生的荧光来确定目标序列。每次反应后拍摄的数字图像随后被用于分析。DNA纳米球测序是一种利用滚动循环复制的连接测序形式。合并的DNA副本被压缩成DNA纳米球，并以密集的斑点网格结合到测序玻片上，准备进行基于连接的测序反应[24,25]。虽然纳米球技术降低了运行成本，但产生的短序列对读图来说可能是个问题。

2G NGS技术总的来说比其他测序技术有一些优势，包括能够以快速、灵敏和经济的方式产生测序读数。然而，也有一些缺点，包括同族聚合物的解释能力差，聚合酶加入不正确的dNTPs，导至测序错误。短读长度也造成需要更深的测序覆盖率，以实现准确的等位基因组和最终基因组组装[26-30]。所有2G NGS技术的主要缺点是在测序前需要进行PCR扩增。这与文库制备（序列GC-含量、片段长度和虚假多样性）和分析（碱基错误/偏爱某些序列而不是其他序列）过程中的PCR偏倚有关。

3G测序的引入规避了对PCR的需求，对单分子进行测序，无需事先扩增步骤。第一个单分子测序（SMS）技术是由Stephen Quake及其同事开发的[31]。在这里，通过监测荧光标记的核苷酸与DNA链的结合，以单碱基的分辨率获得序列信息，并使用DNA聚合酶。根据不同的方法和使用的仪器，3G NGS的一些优势包括：

➤ 实时监测核苷酸的结合情况

➤ 无偏倚测序

➤ 更长的读取长度

然而，高成本、高错误率、大量的测序数据和低读深度都会带来问题[32,33]。

在4G系统中，3G的单分子测序与纳米孔技术相结合。与3G类似，纳米孔技术不需要扩增，采用的是单分子测序的概念，但集成了纳米级直径的微小生物孔（纳米孔），单分子通过这些孔并被识别。4G系统目前提供最快的全基因组序列扫描，但仍然相当昂贵，与2G技术相比容易出错，而且相对较新。因此，目前该技术可用的数据较少[34]。