结直肠癌是威胁人们生命健康的常见恶性肿瘤，其发生发展有清晰的进展分期和较长的检测窗口期，大多遵循“腺瘤—癌”序列，从癌前病变进展到癌一般需要 5～10 年的时间， 为疾病的早期诊断和临床干预提供了重要时间窗口[1]。研究表明结直肠癌筛查和早诊早治可有效降低结直肠癌的死亡率[2-3]。 在结直肠癌的诊断/筛查方法中，血浆ctDNA检测和粪便DNA检测方法因具有无创、无需特殊设备、无需限制饮食等优点，成为近年来的研究热点。其中粪便DNA检测主要针对结直肠脱落细胞的基因突变和/或甲基化等特征，有单靶点和多靶点方案，也可与FIT联合检测[4]。 本期小编主要带大家了解下相关产品国内注册上市情况，之后围绕粪便DNA甲基化检测产品对注册申报过程中的要点做简要介绍。希望给大家带来一些收获，如有不足或不当之处，还请各位同行批评指正。 1 国内已上市相关产品信息介绍 截止2022年7月，国内已上市的同类产品信息见下表。其中有3款产品通过创新通道获批上市，该类产品主要采用荧光定量PCR技术检测粪便或血浆样本中的单靶点或多靶点基因甲基化，预期用途为结直肠癌的辅助诊断或筛查。 表1.国内已上市同类产品信息
来源：以上数据摘自国家药品监督管理局、国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心及企业官网。 a 审评用时指产品从创新申请公示到获批上市的时间间隔； b CRC代表结直肠癌； c AA代表进展期腺瘤。 2 产品分析性能评估需要关注哪些内容？ 该类产品的分析性能研究一般包括核酸提取与转化、准确度、分析特异性、最低检测限和精密度。采用临床样本或细胞系样本进行研究，所用样本的基本信息均需明确，如样本来源、样本类型、甲基化状态确定结果和/或浓度水平、稀释方式、定值过程及数据等，如需稀释，应采用与粪便样本的阴性基质。 2.1核酸提取与转化 核酸提取的目的是富集目标基因浓度并去除PCR抑制物，是决定实验质量的关键环节，无论申报产品中是否包含核酸提取组分，都应对核酸提取环节做详细验证，包括提取效率、提取核酸浓度和纯度、与申报产品的组合性能研究等。 该类产品从粪便样本中获得基因组 DNA后，需用重亚硫酸盐对基因进行转化，所以提交资料中也应包含对转化能力的评价，包括转化效率和核酸回收率等。 2.2 准确度 准确度研究中，除检测阴/阳性参考品符合率外，可采用若干临床样本验证产品检测结果的一致性。临床样本类型覆盖不同分期的结直肠癌患者样本、进展期腺瘤样本、非进展期腺瘤样本、结直肠息肉、结直肠炎症和肠道无异常样本等。 2.3 分析特异性 交叉反应 用于该类产品交叉反应验证的样本种类应考虑以下几种可能性：转化前的结直肠癌粪便样本、其他消化道肿瘤常见甲基化基因样本、其他恶性肿瘤患者粪便样本（食管癌、胃癌、胰腺癌等）和常见肠道微生物样本（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等）等。若检测结果存在一定的交叉反应，应进行风险分析。 干扰试验 干扰试验应采用弱阳性浓度样本，通常是在临床样本中人工添加干扰物质的方式来评价干扰物质对目标基因检测的影响。如有干扰应明确不产生干扰的最高浓度，并在说明书中予以使用者提示。 干扰物质包含内源和外源性干扰物，内源干扰物主要涉及血脂、胆红素、血红蛋白等，外源干扰物主要包括常用药物（黄连素、氧氟沙星、奥美拉唑等）和非人源性物质（动植物DNA）等。 2.4 最低检测限 最低检测限评价主要考虑两个方面，一是在扩增反应终体系特定核酸浓度下，发生甲基化比例的最低检测限。二是在特定甲基化比例下，反应终体系中核酸浓度的最低检测限。 最低检测限建立通常采用临床样本或细胞系，通过配制不同浓度、不同甲基化比例的样本，采用梯度浓度的样本进行多次重复检测，确定适当检出率水平（如：95%）作为检出限，明确在多少基因组DNA浓度下的甲基化比率。最低检测限验证可采用最低检测限浓度附近的临床样本进行检测，同时在上述研究中应明确临床样本或细胞系与人基因组DNA浓度的对应关系。 2.5 精密度 精密度研究与其他定性产品类似，样本类型可采用临床样本或细胞系样本，样本浓度水平包含阴性和弱阳性样本。评价因素包括批内、批间、日内、日间、运行间、人员间、设备间和实验室间等。 3 产品阳性判断值如何确定？ 一般情况下，此类产品的阳性判断值即为针对每个发生甲基化的基因能够获得理想的临床灵敏度和临床特异性的临界值，对应荧光探针PCR方法即为Ct值的确定资料。对于临界Ct值的判定一般采用受试者工作特征曲线（ROC）的方式进行相关研究，应选取具有代表性的、适当的足够数量的临床样本确定阳性判断值。 特殊情况下，当产品检测靶点较多或涵盖不同方法学时，也可通过各个基因的Ct值采用拟合公式法确定阳性判断值，产品检测结果通过与试剂盒配套的分析软件给出。数据分析软件与检测试剂盒同步申报注册，需在试剂盒说明书中列明配套使用的软件版本号。 4 关于临床试验设计的一些思考 4.1 结直肠癌辅助诊断用途 2022年03月，国家药监局医疗器械技术审评中心发布了《人类SDC2基因甲基化检测试剂临床试验资料技术审评要点》，一定程度上为此类产品临床试验的开展和实施提供了参考，简要总结见表2。 表2.结直肠癌辅助诊断用产品临床试验要点
4.2 结直肠癌筛查 目前国内仅批准一款结直肠癌筛查产品，即KRAS基因突变及BMP3/NDRG4基因甲基化和便隐血联合检测试剂盒（PCR荧光探针法-胶体金法）。该产品采用FIT-DNA联合检测方法，入组人群为结直肠癌高风险的人群（40～74岁，便潜血阳性、问卷风险评估阳性或结直肠癌家族史等），在一定程度上能够反应我国结直肠癌高风险人群中结直肠癌和进展期腺瘤的发病率，临床试验针对预期的筛查人群进行前瞻性入组。试验设计采用结肠镜和/或病理检查结果作为参比方法，评价了该产品筛查的临床灵敏度、特异度、阳性/阴性预测值等评价指标，详细数据结果见表1。需注意临床灵敏度和阴性预测值是疾病早筛产品非常关注的性能指标，必须达到较高的水平才能作为筛查产品上市。 同时，审评审批部门要求该产品上市后进一步评价其长期临床性能，以及验证最适合中国人群的筛查间期。 结直肠癌的早诊早筛有助于改变我国高发病率和死亡率、低早期诊断率的现状，按照目前的临床实践及相关结直肠癌早诊筛查专家共识，结肠镜下活检病理检查依然是诊断结直肠癌的金标准，但这种方法侵入性强，且需良好的肠道准备，患者依从性差。而对结直肠癌发生发展过程中的甲基化特异性分子标志物的检测可很好的弥补上述缺陷，给患者提供一种结直肠癌辅助诊断/筛查方法的选择，基于目前的研究结果和临床实践，其检测结果不能取代结直肠镜，仅供临床医生参考。 随着科学的发展，越来越多适用于结直肠癌等辅助诊断的新甲基化靶点被发现，也期待更多更好的甲基化检测试剂注册上市，为广大患者提供更多受益。 参考文献 [1] Dekker E，Tanis PJ，Vleugels JLA，et al. Colorectal cancer[J]. Lancet，2019，394(10207)：1467-1480. [2] Lin JS，Piper MA，Perdue LA，et al. Screening for colorectal cancer：updated evidence report and systematic review for the US Preventive Services Task Force [J]. JAMA，2016，315(23)：2576-2594. [3] Brenner H，Stock C，Hoffmeister M. Effect of screening sigmoidoscopy and screening colonoscopy on colorectal cancer incidence and mortality：systematic review and Meta-analysis of randomised controlled trials and observational studies[J]. BMJ，2014，348：g2467. [4] 国家癌症中心中国结直肠癌筛查与早诊早治指南制定专家组. 中国结直肠癌筛查与早诊早治指南（2020，北京）[J]. 中国肿瘤，2020，30（1）：0001-28. |
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