技术｜如何对ELISA研究方案进行优化

本文描述了从捕获抗体（对于ELISA夹心法）开始，直到酶结合物和底物的选择，对检测的每个组成部分的优化步骤。虽然每个部分都是单独描述的，但在许多情况下，可以通过执行棋盘式滴定法同时优化两个部分，如下图所示。

图1 | 棋盘式滴定实验的例子，同时优化两个ELISA参数

这个例子显示了在所有其他试剂不变的情况下，一阶抗体与检测抗体。研究人员使用研究方案中描述的格式（使用亲和纯化的单克隆抗体）开发ELISA，通常会使用起始浓度为12 μg/mL和5 μg/mL的捕获抗体和检测抗体，酶结合物的恒定浓度为100 ng/mL。在捕获和检测抗体被优化后，酶结合物可以进行滴定，但100 ng/mL通常是合适的。

1. 准备不同浓度的包被缓冲液中的捕获抗体（见附录中描述的范围）。

2. 将等量的每种浓度的抗体涂抹在平板上，并从研究方案的第2步开始进行。

3. 检查信号强度与背景杂音。

1. 准备不同的封闭液。如果封闭液不是预先配制的（即是单一的蛋白质，如BSA），尝试不同浓度的蛋白质。

2. 在平板上涂抹等量的每种溶液，然后从研究方案的第4步开始。

3. 检查信号强度与背景杂音。

1. 尽量使标准稀释液与样品的基质相匹配。如果基质本身不能被完全复制，则测试不同的标准稀释液溶液。

2. 在平板上涂抹等体积的标准稀释液，然后从研究方案的第5步开始。

3. 检查标准曲线的动态范围和样品的稀释线性是否良好。

4. 如果标准曲线的动态范围不好，那么可能需要选择不同的稀释剂。如果样品在稀释液中的线性稀释度很差，可能是样品基质和标准稀释液之间存在不平衡。在这种情况下，应进行尖峰-恢复或线性稀释实验。