与学习任何新技术一样，单细胞测序工作流程中可能有一些元素是你目前不熟悉的。虽然像流式细胞仪、RNA-seq和qPCR等方法已经在你的流程和机构中建立起来，但用一种新方法将你的研究提高到一个新水平的可能性可以抵消学习曲线。 单细胞测序和这些方法之间的差异，包括第二代测序的实施和数据分析，不应该被最小化，然而它们之间有许多相似之处，可以让你对自己踏入单细胞测序世界的能力充满信心。过去的训练和实验，像肌肉记忆一样，有助于技术知识、动手能力和直觉。 这些，再加上实践，将使你在新方法上取得成功。 1、样品预处理 每一个生物实验，包括单细胞技术，都可以分解成几个关键步骤：准备样品，运行测定，以及观察结果。
图1 | 每个单细胞实验的三个基本步骤 单细胞测序实验的第一步，样品制备，与你作为流式细胞仪用户可能已经熟悉的步骤密切相关，即从通过酶解或机械过程、细胞分选或其他细胞分离技术消化的整个样品中生成有活力的单细胞悬浮液。 随后是细胞计数和质量控制步骤，以确保你的样品有适当浓度的活细胞，并且没有结块和死细胞碎片。如果需要，你也可以用抗体对你的样品进行染色，以标记细胞表面蛋白和其他生物分析物，或对感兴趣的细胞类型进行FACS富集。 解离样品的步骤将根据你的起始材料和你的实验目标而有所不同。额外的准备步骤可能是必要的，这取决于组织的质量、样品的丰度、细胞的大小，或需要从基因组DNA中提取细胞核进行染色质可及性分析。不管这些具体的考虑，生成高质量单细胞悬液的基本原则适用于所有的样品类型。
图2 | 描绘了细胞测量技术，如流式细胞仪和10x基因组公司的单细胞测序技术之间的相似性和差异 2、关于cDNA的三种基因表达方式 单细胞RNA-seq、RNA-seq和反转录qPCR（RT-qPCR）有一个共同的过程，即分离RNA并将其转换为cDNA进行分析。然而，每种检测方法在如何进行这一过程和最终读出结果方面有所不同。 RNA-seq和RT-qPCR都是先从大量的细胞群中分离出RNA，然后将其转化为cDNA。对于RNA-seq，cDNA被用来创建第二代测序库，从而能够测量整个转录组的基因表达。对于RT-qPCR，特定的目标从cDNA中扩增，并通过荧光测量表达水平。RT-qPCR仅限于已知目标，而RNA-seq则提供无偏见的整个转录组基因表达。 然而，两者都只提供了一个细胞群的平均基因表达的观点。使用单细胞RNA-seq，在分离RNA之前，单细胞被分离到井或单个微反应容器中。然后RNA被贴上细胞特异性的条形码，确保每个细胞的cDNA可以被追溯到原生细胞。与RNA-seq类似，条形码的cDNA被用来创建第二代测序库，使每个细胞的整个转录组的基因表达得到测量。
图3 | 单细胞测序是如何工作的
图4 | RT-qPCR和单细胞测序技术的异同 3、共同的目标，了解转录组 无论是从RNA-seq或RT-qPCR的大宗样品的RNA开始，还是从单细胞RNA-seq的单细胞开始，每种技术最终都在寻找相同的终点数据：基因表达的水平。 在这些检测中，有一个共同的数据分析方法，包括分析实验或样本条件之间的差异性基因表达，如正常与疾病。例如，比较对照样本和炎症皮肤组织的转录谱，可以发现定义炎症状态的转录特征，以及在疾病背景下失调的基因活动。有了单细胞分辨率，你可以将这些转录的洞察力提升到一个新的水平，确定是否有一个特定的细胞子集负责炎症反应。 利用你通过RNA-seq和RT-qPCR实验量化基因表达的经验中已知的基因表达标记，以及熟悉的差异基因表达分析模式--类似于RNA-seq和RT-qPCR数据--跳到单细胞基因表达可以非常直观。此外，10x Genomics软件可以帮助你顺利过渡到单细胞数据，并提供易于使用的数据分析和可视化工具。 对如何分析单细胞测序数据有更多疑问？跳转到第5章，了解我们的工具介绍和如何寻找支持。
图5 |批量RNA-seq和单细胞测序技术的异同 第二代测序技术如何用于单细胞实验 我们想对第二代测序库的构建方式做一个简短的概述。 首先，第二代测序（NGS）是一种确定DNA和RNA序列的高通量方法，具体应用于寻找序列的变异和确定基因表达模式。单细胞RNA测序仪可以通过测序和计数转录本来测量基因表达水平。 NGS文库的制备是通过PCR将测序特定的适配体添加到cDNA片段的末端。这就形成了一个cDNA片段库，其上标有10倍的特异性序列，用于将转录本映射到它们的原生细胞，以及用于测序仪内反应的测序引物。 4、用单细胞多组学提升洞察力 基于测序的读数最终是强大的，因为它可以从同一个单细胞中获得多种生物分析物。如果说单细胞基因表达以一种颜色提供高度详细的信息，那么单细胞多组学提供同样的细节，但跨越整个色谱，让你对样品有最真实的了解。 相对于传统方法，单细胞多组学简化了你需要运行的实验和需要分析的样本，以获得同等的结果。这不仅节约了宝贵的样本，而且还确保了更大的生物学准确性，因为你不需要从分裂的样本中匹配数据集，也不需要通过计算来推断不同组学之间的关系。 单细胞测序实验的最终结果非常值得我们努力去了解和胜任它的运行。随着实验的完成和数据的掌握，发现开始了。 参考文献 [1] Wagner E. Monitoring gene expression: 3. https://www.illumina.com/science/technology/ quantitative real-time rt-PCR. Methods Mol Biol next-generation-sequencing/beginners/ngs-1027: 19–45 (2013). workflow.html [2] https://www.illumina.com/science/technology/ next-generation-sequencing.html |
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