技术｜PCR基本故障排除清单

除了标准的PCR扩增外，该技术的变体也被开发出来。其中包括逆转录PCR（RT-PCR）[2]、定量实时PCR（qPCR）[3]和数字液滴PCR（ddPCR）[4]。尽管被广泛采用和常规使用，但也会出现错误，导至PCR产物质量差，从而导至不可靠的结果。

正确的PCR方案设计和优化可以帮助减少错误。对PCR原理的理解、对常见错误的认识以及经验可以帮助研究人员首先防止问题的发生，并在问题发生时进行故障排除。本文将简要介绍PCR反应的各个组成部分以及优化新方案所需的前期知识。

重点将放在标准PCR扩增上，如基因分型和克隆，但这些原则广泛适用于大多数PCR反应类型。本文还提供了一份PCR故障排除步骤的清单，你可以用它来帮助解决PCR反应中出现的任何问题。

1.1、引物

最佳的引物必须符合与[5]有关的标准：

1)   长度，引物应包括16 ~ 28个碱基对（bp），而且引物对的差异不应超过3bp；

2)    融化温度（Tm），每个引物应在50-62°C，引物对应相差不超过5°；

3)     CGuanine-cytosine（GC）含量，GC成分应在40 ~ 60%的范围内；

4)      引物3′末端的GC配对；

5)      结构，引物不应形成发夹自互补性。为了避免引物二聚体，引物不应该是自互补的；

6)      避免非靶标，引物不应该与非靶标DNA序列互补。

引物的设计应使用具有内置算法的软件来考虑所有标准。为qPCR设计引物有其自身的挑战[6]。

1.2、模板质量

模板可以是质粒或组织或血液中的基因组DNA（gDNA），其质量应予检查。质粒的质量可以通过对完整的和限制性消化的质粒进行凝胶电泳来验证，质粒应该形成一个明显的和预期的带状图案。

质粒DNA和gDNA的质量都可以通过纳米滴定仪测量260和280纳米处的吸光度比值（A260/280）来验证，其范围应在1.8到2.0之间。

1.3、主MIX

现在有几种类型的聚合酶，PCR反应的选择将取决于具体的应用[7]。一般的Taq聚合酶容易出错，但很经济，所以适合于常规的基因分型。对于必须没有任何序列错误的PCR产品来说，需要具有校对能力的高保真聚合酶，如扩增用于克隆到表达质粒的cDNA。

热启动聚合酶是一种聚合酶，通过在较低温度下使DNA聚合酶可逆性失活来降低非特异性DNA扩增的机会，而扩增富含GC的DNA可能需要加入二甲基亚砜（DMSO），最好用特种聚合酶进行。

1.4、仪器故障

为了排除任何PCR运行过程中的仪器故障，在运行的PCR反应中必须始终包括一个阳性质控。

1.5、操作员失误

研究人员可能选择了错误的PCR程序，或者正确的程序可能在无意中被修改。在开始PCR反应前检查程序是很好的做法。

1.6、测定设计和优化

纳入阳性和阴性对照对于排除问题至关重要，如出现意料之外的条带，或没有任何生成物。此外，有几个参数可以改变，这将有助于优化PCR产物。这些参数在第一次建立方案时特别重要，包括：

1)    引物浓度；

2)    模板浓度；

3)    盐浓度；

4)    退火温度，以及

5)    循环次数。

应进行初步试运行，以确定产生最佳PCR产物的条件，即没有非特异性条带的最高产量。

2.1、没有产物

➤   遗漏了PCR试剂，重复PCR反应，但要进行核对，以确保所有成分都加入。

➤   引物设计不良，重复引物设计过程，再次检查引物特异性，尝试增加引物长度，或采用不同的设计方法。在文献或数据库中搜索能扩增预期DNA片段的有效引物。

➤   引物不足，确认引物储备准备正确。通过改变引物的浓度来重复测试；通常的范围是0.05 ~ 1 μM。

➤   引物质量差，引物可能是旧的或退化的。用纳米滴定仪检查其质量，用新鲜引物替换。

➤   模板质量差，用凝胶电泳分析质粒，用纳米滴管的A260/280比率分析质粒和gDNA，以评估其质量。进一步纯化模板DNA。

➤   复杂模板，除非使用特殊的聚合酶，否则从富含GC的片段或较长的模板进行扩增可能是次优的[7]。模板浓度在质粒（每50μL反应1pg10 ng）和gDNA（每50μL反应1 ng-1μg）之间的扩增有所不同。

➤   次优的盐条件，镁阳离子（Mg2+）作为聚合酶的辅助因子；因此，低镁盐水平会降低聚合酶的活性。用不同的镁盐浓度进行一系列测试PCR反应，以确定最佳水平。另外，在解冻镁盐储备时要彻底涡旋，以重新悬浮储存时沉淀的任何盐。

➤   存在反应抑制物或污染物，进一步纯化模板DNA，高压灭菌PCR管，或使用新鲜试剂。

➤   循环不足，用不同的循环进行测试PCR反应，以确定理想的数量。

➤   延伸时间不足，如果没有给聚合酶足够的时间来扩增DNA，那么就不会有产物。核实制造商的聚合酶速率，并计算出足够长的延伸时间，以使DNA得到扩增。

➤   不正确的PCR程序，检查是否使用了正确的程序，或者正确的程序没有被无意中改变。核实PCR程序并重复PCR反应。

➤   退火温度不正确，退火温度可能太高。检查所设计的引物的预期Tm，通过使用退火温度梯度进行测试。

➤   退火时间不正确，退火时间可能太短；没有给引物足够的时间与模板结合。

➤   阻断温度不正确，如果阻断温度不正确，退火、延伸和熔化温度将不准确。为了纠正，请进行加热块校准。

2.2、结果微弱

➤   引物不足，引物质量差，模板质量差，模板复杂，盐条件不理想，存在反应抑制剂或污染物，循环不足。

➤   脱氧核苷三磷酸酯（dNTPs）降解，dNTPs可能因反复冻融循环而降解。等分库存以减少降解。

➤   不正确的变性温度，变性温度可能太低；模板融化不理想，导至扩增效率低。

➤   不正确的变性时间，变性持续时间可能太短；没有给模板足够的时间熔化，导至扩增效率低。

2.3、不正确或非特异性产物

➤   引物设计不正确，引物没有设计成能扩增所需的DNA片段，导至产物大小不正确。重新设计引物以扩增正确的片段。当出现非特异性条带时，增加引物长度以加强模板结合，尽量减少错误引物。

➤   引物缺乏特异性，检查引物在模板DNA中是否有额外的互补区域。

➤   引物过量，检查确定引物储备的制备是否正确。通过改变引物浓度来重复试运行；通常的范围是0.05-1μM。

➤   模板浓度不正确，从质粒（每50μL反应1pg-10ng）到gDNA（每50μL反应1ng-1μg）的扩增，模板浓度不同。检查模板浓度并调整PCR反应的体积。运行测试反应以确定最佳浓度。

➤   次优的盐条件，镁离子可增强引物与模板结合的稳定性，增加引物与不完全互补的模板序列的亲和力。用不同的镁盐浓度进行一系列的测试PCR反应，以确定最佳水平。另外，在解冻镁盐浆时，彻底涡旋，以重新悬浮任何可能在储存时沉淀的盐。

➤   不正确的退火温度，如果退火温度太低，可能会发生误吸，导至大小不一的条带。

➤   不正确的退火时间，退火时间可能太长；使引物有更多的时间与模板发生误植。

➤   过早复制，在冰上准备PCR反应，使用热启动聚合酶，并将PCR机预热到变性温度。

➤   外源性DNA的污染，使用新鲜试剂，在专门的净化区工作。

➤   核酸酶污染，使用新鲜试剂重复PCR反应。

2.4、序列错误

➤   低保真聚合酶，低保真度的聚合酶比高保真度的聚合酶更频繁地发生复制错误。

➤   循环次数太多，不必要的循环会增加聚合酶出错的可能性。进行测试反应以确定所需的最小循环次数。

➤   不理想的盐条件，降低PCR反应中的镁盐浓度。

➤   降解或不平衡的dNTPs浓度，等分dNTP储备以减少冻融循环造成的降解；确保储备中含有等量的dATP、dCTP、dGTP和dTTP。PCR反应的dNTP含量可能过高，用较低的浓度测试反应条件。

➤   模板质量差，模板可能在纯化过程中被剪切或缺口，或因紫外线照射而损坏。准备新鲜模板并重复PCR反应。

➤   降解的PCR产物，如果PCR产物在凝胶中切除条带之前在紫外光下被成像，那么它可能被损坏。重复PCR反应，但要限制紫外线照射，并加快工作速度以切除条带。

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