技术｜如何选择合适的DNA片段尺寸，为测序带来更好的数据

第二代测序（NGS）技术的引入导至我们的基因组学方法发生了根本性转变。NGS指的是1977年Sanger DNA测序方法首次出现后几十年开发的深度、高通量、平行DNA测序技术，然后主导了三十年。即使是现在，在第二代测序仪到来十多年后，市场仍在继续增长。

这是由于测序成本的不断降低，同时向更多的研究人员和应用开放该技术而形成的局面。但是，尽管这些成本逐年降低，但单个测序运行仍然昂贵。通过优化上游文库构建和样品制备步骤，最大限度地提高任何特定运行的可用数据，可以带来相当多的费用节省。

这些过程费用不高，但对最终数据质量有很大影响。以下是为什么文库片段大小的选择是实现数据质量的关键步骤，以及关于进行大小选择的主要方法的建议，和它们的优点和缺点。

虽然有多种测序方法，但Illumina的合成测序方法仍然是最广泛的，它有几个常见的建库步骤，包括：

➤   通过酶法或机械手段进行破碎。

➤   末端修复和处理，使异质的片段末端均匀化。

➤   用于簇生成和细胞内克隆扩增的适配体连接。

➤   规模选择，以去除不理想的片段大小和任何适配体二聚体。

基因组测序依赖于高质量的文库。其中一部分是确保文库片段大小在特定仪器的最佳范围内，对于Illumina systems来说通常是200 ~ 500 bp。这个范围是片段长度对集群产生的影响和测序过程本身的效率的结果。

小片段往往比大片段更有效地在流动池上聚集。对较小片段的偏爱使大部分的测序能力得不到利用。选择低于150bp的片段可能会有不需要的适配体和引物二聚体的携带风险，其测序会导至大量无法使用的数据和进一步浪费能力。

大于最佳尺寸的片段则构成了相反的挑战。尽管有可能对长度大于1kb的片段进行测序，但这是低效的，而且容易出错，这就是第三代测序试图解决的问题。

个别样品也可能有不同的剪切曲线，分布从窄到宽。例如，当存在200 ~ 1000bp的分布时，将仪器设置为600bp的片段，意味着许多测序模板将不可行或读到足够的深度。这将产生很少的有用数据和低均匀性的覆盖。

尺寸选择的步骤使你能够取一个随机片段库，只提取符合仪器和应用最佳/目标范围的片段（图1）。这样就可以通过最大限度地提高测序运行效率来节省时间和成本。

图1 | 酶切DNA片段有双重尺寸选择

有很多种不同的破碎方法，其中一些试图完全绕过对大小选择的需要。因此，方法的选择取决于你的应用、起始材料和可用的设备。

酶法往往不是完全随机的，而是通过不同的孵化时间对片段大小进行一些控制。然而，由于有可能产生较少的重叠片段，这些方法不太适合于从头组装。

机械剪切有多种选择，使用超声处理或聚焦声学技术。这些都是随机的，可以进行调整以产生可预测的剪切曲线。

尺寸选择的方法包括酶法、凝胶法和磁珠法，每种方法的适用性取决于实验的需要。这些方法也提供了一个机会来清理适配体二聚体和任何其他剩余的试剂。

酶法

Illumina的Nextera试剂盒在一个步骤中产生了与Illumina技术兼容的各种应用库。

在推出时，它们试图通过使用基于转座子的破碎和标记来绕过对大小选择的需求，从而节省了几个工作流程步骤。然而，文库概况往往很宽泛，使用户常常要重新进行单独的大小选择步骤。

基于凝胶的方法

凝胶长期以来一直被用于核酸纯化，使你能够物理地去除所选择的片段大小。基于凝胶的系统，如Sage的Pippin Prep.，有助于实现这一过程的自动化，但其本身的产量有限。一个典型的96个样本的批次需要接近10个小时来处理。

基于磁珠的方法

用于方便和高通量大小选择和清理的磁珠的引入改变了NGS的工作流程。

这些磁珠最初是为分离PCR产物而开发的，其聚苯乙烯核心被磁铁矿和一层羧基分子覆盖。在聚乙二醇（PEG）和盐的存在下，核酸与它们可逆地结合；这一过程被称为固相可逆固定化。

这些珠子在其他方面是惰性的，由于表面积大，具有很高的结合能力。通过简单地改变PEG/盐/珠子与DNA的体积比，可以调整结合片段的大小。从实用的角度来看，这种磁珠化学方法可以直接对非常具体的片段范围进行一致和可重复的尺寸选择。

基于磁珠的方法很适合自动化的高通量应用，而且与其他方法相比，试剂的成本也很低。这些特性使磁珠成为优化NGS样品制备的简单解决方案。