FDA | 新冠核酸检测试剂提交资料模板

本部分内容摘自《分子诊断测试开发商的模板》的“附录A”部分，全文及英文原件下载，请见问文后。

附录A：介质混合确认研究

初步的临床样本混合确认研究

测试开发商应该用单个阳性临床样本进行初步的临床样本混检确认研究，比较考核方法在测试n混1样本混检时的表现和参比方法在检测单个样本时的表现。我们建议只使用经EUA授权的高灵敏度RT-PCR检测，该检测使用化学裂解步骤，然后进行核酸的固相萃取（如磁珠萃取）作为参比方法。如果可以的话，FDA建议选择一个已经建立了高灵敏度的国际公认标准或FDA SARS-CoV-2参考小组的参比方法。本研究设计是在假设研究使用单独的参比方法的情况下编写的。正如前面所讨论的，如果要求在以前授权的检测中增加混合检测，可能不需要单独的参比方法，这个研究设计可以相应的修改。

我们建议测试开发商在这项初步的临床样本混检确认研究中至少评估20个阳性临床样本（可以是回顾样本），由参比方法测试确定，并有足够的数量。这20个样本应包括25%的弱阳性样本，由参比方法确定（即（SARS-CoV-2阳性样本的Ct值应在参比方法的LoD的平均Ct值的1 ~ 3个Ct之内）。如果由参比方法确定的弱阳性样本占阳性样本总数的25%以下，测试开发商最好用额外的天然弱阳性样本来补充确认样本集，使其达到入选阳性样本总数的25%。然而，用单个或混合的天然阴性样本稀释单个天然阳性样本以达到25%的目标也是合适的。如果获得了回顾样本，测试开发商应考虑使用最近的回顾样本，以尽量减少由于长期储存而导至的样品降解的潜在风险。

在初步的临床样本混检确认研究中，所有的阳性样本都应该由考核方法和参比方法进行单独测试。为了描述考核方法在测试混样时的性能，每个单独的阳性样本（由参比方法确定）应与n-1（例如，当n=5时，n-1=4）例阴性样本混检，这由考核方法确定。由此产生的混样，每个样本由1个阳性样本和n-1个阴性样本组成，应通过考核方法进行检测。

为了在这个初步确认研究中构建20个n混1样本进行检测，测试开发商应从预期使用人群中使用适当数量的单个阴性样本（由考核方法确定）。虽然在一个给定的n混1样本阳性混样中的（n-1）个阴性样本应该都是收集自独特个体的不同阴性样本，但相同的阴性样本可以用于建立不同的n混1样本的阳性混样。

基于这个推荐的研究设计，初步的临床混样确认研究应该为每个混合阳性样本产生以下三种类型的结果。考核方法单个样品检测结果（Candidate individual），考核方法混合样品检测结果（Candidate pool），以及参比方法单个样品检测结果（Comparator individual）。

应初步估计使用考核方法的单个样品和使用参比方法试验的单个样品之间的PPA（PPA，Candidate individual vs. Comparator individual）。如果PPA（Candidate individual vs. Comparator individual）小于95%，则不应使用考核方法来测试混合样品。如果PPA（Candidate individual vs. Comparator individual） ≥ 95%，则应计算使用考核方法检测混合样品和使用参比方法检测单个样品之间的PPA（PPA，Candidate pool vs. Comparator individual），即考核方法的阳性混样在参比方法的20个单个阳性样品中的百分比。在计算初步临床混样确认研究的PPA时，所有测试混样的非阴性结果都应算作与单个测试的阳性结果一致。

如果PPA（Candidate pool vs. Comparator individual） ≥ 80%，则n混1样本得到初步确认。如果PPA（Candidate pool vs. Comparator individual） < 80%，测试开发商应以较小的样本量对初步确认研究进行复测，以补偿由于在较大的测试样本量下混合而造成的测试灵敏度的过度损失，直到较小的样本量的PPA（Candidate pool vs. Comparator individual） ≥ 80%。如果有足够的数量，在评估较大样本量时使用的相同的阳性样本可用于较小样本量的确认。如果在评估的任何混样数量中都不能达到 ≥ 80%的PPA（Candidate pool vs. Comparator individual），那么考核方法就不应该被用来测试混样的样本。

为了确认阴性样本在n混1样本中保持阴性，测试开发商还应该在初步临床混样确认研究中测试足够数量的单个阴性样本，由考核方法确定，以产生至少20个混样，每个混样由n个阴性样本组成，使用考核方法进行检测。例如，建议用100个阴性样本组成20个5混1阴性混样（5 × 20个阴性样本）。如果有足够的体积，可以用相同的阴性样本来建立阳性和阴性混样。

来自三个美国不同地域的样本的临床样本混检确认研究

对于打算在多个实验室地点进行的检测（即分布式检测），或在单一实验室地点接受来自不同地域的样本，应进行以下确认，以评估在可能具有不同病毒负荷分布和不同阳性率的人群中进行的混合检测。

A)         方案A（适用于所有测试）

测试开发商应在三个美国不同地域的地点对单个阳性临床样本进行额外的临床混样确认研究，评估测试n混1样本（n是初步确认的混样数量）和使用考核方法检测单个样本之间的PPA（Candidate pool vs. Comparator individual）。三个机构中的每一个都应启动n混1混样，并登记至少15个连续的阳性样本，并有足够的数量，总共至少有45个连续的阳性样本。

每个机构的确认研究应从起始时间T0开始，并应包括与混合检测并行的单个样本检测。然而，由于所有的非阴性混样都需要对包含在池中的所有单个样品进行检测，作为n混1样本和去卷积工作流程的一部分，确认研究基本上增加了对阴性n混1样本的单个样品检测。

每个机构的确认研究可以在时间T1结束，即获得至少15个连续的阳性个体结果，包括在n混1样本和去卷积工作流程后对非阴性混样的样品进行单个测试产生的阳性个体结果，以及从T0到T1[T0, T1]时间段内对阴性混样的样品进行单个测试得到的阳性个体结果。

将阴性混样中阳性个体结果的数量定义为K，在每个地点使用考核方法检测n混1样本（n为初步确认的混样数量）和单个样品之间的PPA应计算为PPA（Candidate pool vs. Comparator individual） = 100% × （15-K）/15。至关重要的是，在PPA的计算中要包括[T0, T1]时间段的所有连续阳性样本。在计算该样本混检确认研究的PPA时，所有混样的非阴性结果都应算作与单个测试的阳性结果一致。测试开发商应分别提出三个美国不同地域的机构的PPA（Candidate pool vs. Comparator individual）。

三个美国不同地域的临床样本混检确认研究方案A的验收标准：

• 如果每个地点的PPA（Candidate pool vs. Comparator individual） ≥ 85%，确认数据支持n混1样本混检。
  

• 如果PPA（Candidate pool vs. Comparator individual）在3个机构中的2个机构 ≥ 85%，在PPA（Candidate pool vs. Comparator individual） < 85%的机构，应产生至少15个额外的连续阳性样本的额外数据，并计算至少30个连续阳性样本的综合数据的PPA（Candidate pool vs. Comparator individual）的估计值，总体PPA目标为 ≥ 85%。

• 如果PPA（Candidate pool vs. Comparator individual）在0个机构或3个机构中的1个机构  5%，或1个机构的PPA（Candidate pool vs. Comparator individual） < 85%，用至少30个连续阳性样本的综合数据计算，确认数据不支持n混1样本混检，应考虑并确认一个新的，更小的n值（例如n-1）。

B)         方案B（适合于能产生Ct值的RT-PCR检测）

作为评估三个美国不同地域的PPA（Candidate pool vs. Comparator individual）的替代方法，测试开发商可以从三个美国不同地域的机构获取历史上的单个样本检测阳性结果，对每个机构的PPA（Candidate pool vs. Comparator individual）进行干试验分析。我们建议从这三个机构中的每一个获取至少30个连续的单个测试阳性结果（可以是最近获得的历史数据），总共至少有90个连续的个体阳性结果。

为了进行干试验PPA（Candidate pool vs. Comparator individual）分析，对于每个考核方法目标，测试开发商应使用考核方法在n × LoD、LoD和LoD/n浓度的，从初步临床混样确认研究中生成的湿实验数据和用样本稀释液稀释阳性临床样本的额外湿实验复测数据来估计对应于 n混1样本（稀释度为1:n）的Ct偏移，如下所述：

• 通过在阴性临床混样中测试连续稀释的阳性临床样本来评估LoD。

• 在n × LoD浓度下对该阳性临床样本（指定为样本A）进行5次复测；

• 在LoD浓度下，对样品A和（n-1）个阴性临床样品混样（指定为样品B）进行10次复测；

• 造LoD/n浓度下，对样品B和（n-1）个阴性临床样品混样（指定为样品C）进行10次复测。样品C的阳性结果的百分比被指定为%D。

以下是关于估计与n混1样本（稀释度为1:n）相对应Ct偏移的建议。

• 利用在初步临床混样确认研究中湿实验20个阳性临床样本的数据，以及样本A的第一次复测（样本A单个Ct）和样本B的第一次复测（样本A混样Ct），构建并展示混样Ct（Y轴）与单个Ct（X轴）的散点图。

• 根据单个Ct值将数据点分为3个子区间：~7个Ct高值的点，~7个Ct中值的点，和~7个Ct低值的点。

• 计算每个数据点的混样Ct（Y轴）与单个Ct（X轴）之间的差异，并计算每个子区间的差异平均值，即平均Ct低值、平均Ct中值、平均Ct高值。

• 目测分析是否存在单个Ct高值的差异平均值大于单个Ct低值的差异平均值的趋势。

• 如果观察到这种趋势，使用平均Ct高值作为n混1样本的Ct偏移的估计值。如果没有观察到这种趋势，取所有21个样品的差异的平均值，并使用这个平均值作为n混1样本的Ct偏移的估计值。

使用n混1样本的估计Ct偏移（Ct Shift）和在n x LoD、LoD和LoD/n浓度的复测中对一个稀释阳性临床样本进行湿实验的数据，可以为每个候选检测目标建立以下干试验PPA（Candidate pool vs. Comparator individual）分析规则：

测试开发商应分别对三个美国不同地域的机构进行干试验分析并提出PPA（Candidate pool vs. Comparator individual）。

为了减轻打算在FDA授权后利用考核方法检测混样的单个实验室客户负担，关于样本混检实施后的持续监测，我们强烈建议检测开发商进行初步的临床样本混检确认和湿实验，对所有小于或等于n的混样规模（即，n = 5、4、3和2），以确定每一种混样数量的测试分析灵敏度的降低（即Ct值的变化和可能由于混样而被遗漏的低病毒载量的单个阳性样品的百分比）。确认的目的是生成以下参考表，并将其纳入使用说明：

• 一个参考表，包含了对所有经过确认混样数量的每个候选检测目标进行干试验PPA（候选样本与候选个体）分析的规则，这样，每个打算利用该检测方法检测混样的实验室可以利用这些规则进行干试验PPA分析，作为混样实施后持续监测计划的一部分。

  有关混样重新评估的更多信息见附录B。

在三个美国不同地域进行的临床样本混检确认研究的方案B的接受标准：

• 如果每个机构的PPA（Candidate pool vs. Comparator individual）在干试验分析中 ≥ 85%，则历史数据支持n混1样本混合。

• 如果3个机构中的2个的PPA（Candidate pool vs. Comparator individual）干试验分析值≥85%，在PPA（Candidate pool vs. Comparator individual）干试验分析值 < 85%的机构，应从至少30个额外的连续阳性样本中获得额外的历史个体检测数据，并计算至少60个连续阳性样本的综合数据的PPA（Candidate pool vs. Comparator individual）干试验分析值。

• 如果PPA（Candidate pool vs. Comparator individual）干试验分析值在3个机构中的0个或1个机构 ≥ 85%，或1个机构的PPA（Candidate pool vs. Comparator individual）干试验分析值 < 85%，则干试验分析值确认数据不支持n混1样本混合，应考虑并确认新的，更小的n值（例如n-1）。

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