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PCR试剂前期引物探针确定指标分析

2021-9-13 14:36| 编辑: 归去来兮| 查看: 305| 评论: 0|来源: 小桔灯网 | 作者:山欸岖

摘要: PCR试剂前期的验证引物探针性能和确定最适反应条件是确保正式实验顺利进行的前提。


来源:小桔灯网

作者:山欸岖


PCR试剂前期的验证引物探针性能和确定最适反应条件是确保正式实验顺利进行的前提。


那么前期验证引物探针我们需要怎么确定呢?

主要指标是基线、扩增曲线、Ct值、扩增效率、低浓度样本检出、CV等。


一、基线

基线是PCR扩增曲线中水平的线,在PCR扩增反应的最初数个循环中,荧光信号变化不大,成一条直线,这条直线即基线。

在PCR引物探针筛选时,要注意基线是否水平。引物探针浓度纯度都会影响基线,如导至基线上抬,下降等。而基线也是一个很直观的指标。


二、扩增曲线

另一个直观地指标是扩增曲线形态,最好呈S形曲线,避免有二次扩增,或者其他不正常的扩增曲线。


三、Ct值

从基线到指数增长的拐点对应的循环次数为Ct值。

对于同一个样本,不同的引物探针结果为不同的扩增曲线,对应的Ct值受扩增效率,干扰程度等影响会不一样,理论上我们选择的引物探针Ct值越小越好。


四、扩增效率

评估PCR扩增效率最可靠和稳定的一种方法是标准曲线,也是被研究者们广泛认可的。该方法涉及到制作一系列的样品来控制目标模板的相对数量。这些样品通常由浓缩的原液连续稀释而成,最常用的是10倍稀释。使用一系列稀释样品,采用标准qPCR程序进行扩增获得Cq值,最后根据各样品浓度及相应的Cq值绘制标准曲线,得到线性方程Cq= -klgX0+b,扩增效率E=10(-1/k)-1。利用qPCR进行定量分析时,要求扩增效率范围在90%-110%(3.6>k>3.1)。


五、低浓度样本检出情况

样本浓度较低时,不同引物探针的检出率有差异,我们选择20个低浓度样本重复,以最高检测率的引物探针体系为最佳。


六、变异系数CV

可以根据核酸扩增检测用试剂的行标,不同的引物探针检测10个重复样本。


定量试剂:

定性试剂:


PCR试剂前期验证工作也很重要,型检、注册资料都是需要详细撰写的。

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