诊断技术｜引物的设计-引言

引物是任何PCR检测的关键组成部分，因为它们是决定其特异性、敏感性和稳定性的主要因素。

尽管发表了许多指南，但许多已发表的检测方法的实际设计往往是不健全的，例如，引物缺乏声称的特异性，它们可能不得不在其结合位点与二级结构竞争，引物二聚体的形成可能影响检测的灵敏度，或者它们可能只在一个狭窄的温度范围内结合。

本篇文章的目标是为引物设计提供一些简单的指导，从而避免这些最常见的问题。

任何基于PCR的实验的成功，在很大程度上取决于对引物设计的勤奋和关注。

这个过程必须经过一系列确定的程序，我们可以将它们分为模拟研究和实验研究，即湿式实验。

对检测设计的模拟研究分析可以预测引物的特性和随后的检测行为，但不能替代对这些预期的实验性确认。

因此，任何PCR检测设计的一个重要部分是，每一个模拟研究预测必须经过广泛的实验优化和验证。

这需要时间、精力和费用，但这是进行PCR检测的一个组成部分。实验验证越彻底，随后的结果就越有可能具有生物相关性。

本文的重点是湿式实验的工作流程，它被总结在图1中，涉及确定提供最佳引物组合和检测条件的过程，以便产生可靠、准确和可重复的检测结果。

值得强调的是，优化数据是依赖于母液的；也就是说，如果使用不同的母液，对一种母液最有利的引物设计、浓度和退火条件可能不会被延续。

图1 | 引物优化湿式实验的工作流程

一般来说，大多数PCR引物的特点是有以下参数。

• 引物必须足够复杂，以减少与所选目标以外的序列退火的可能性。在任何给定的DNA序列中，有1:256的机会找到特定的四个核苷酸序列。因此，据统计，一个18个碱基的序列在每6.81010个碱基中只出现一次，大约是人类基因组大小的20倍。每增加一个核苷酸就会使引物的特异性提高四倍，这使得引物的理想长度在18至24个核苷酸之间。然而，寡核苷酸越长，就越有可能形成二级结构，对PCR效率产生负面影响。只有在扩增预期有目标异质性的目标时，在使用诱变引物或增加额外的序列信息（如RNA聚合酶结合位点）时，才需要较长的引物。

• 退火温度（Ta）应在60~65℃之间。然而，一些应用可能需要修改引物长度和Ta。例如，针对富含AT的细菌基因组DNA的引物可能需要更长，针对富含GC的真菌基因组DNA的引物可能需要更短。作为拉长富含AT的序列的一种选择，可以包括修改过的碱基（如LNA以增加给定位置或沿引物的有效Ta）。

• 虽然引物对的GC含量应在50%左右，但这并不是一个无条件的要求。太高的GC含量会导至误植，因为这样的引物与非目标模板退火更稳定。即使错误引物只是短暂的，它也足以启动Taq（或其他DNA）聚合酶的引物。如果这种情况发生在PCR反应的前几个循环中，非特异性产物将被扩增，并可能使结果变得模糊。如果PCR反应的目标是富含GC的目标，退火时间必须保持短。

• 引物不应该有任何明显的二级结构，因为这些结构会明显影响PCR的效率。

• 引物之间不应存在互补性，特别是在它们的3’端。应避免出现四个或更多的相同核苷酸，特别是G或C，但只要它们不出现在3’端，就可能不会影响引物的性能。

我们强调，这些准则通常是适当的。在实践中，不遵循设计规则的引物组可能会产生所需的PCR扩增子，并具有可接受的产量。引物优化将一个不受控制的过程变成一个由用户控制的过程。