【冯仁丰】国内实现溯源性需要考虑的问题（8）认识基质效应（4）

        EP14文件中叙述的基质效应，是专门关注于日常使用的控制品、校准品以及室间质量评估使用的调查品，它们与病人新鲜血清间的基质差异所致的“基质效应”。采用了比对的方法去显示该效应的存在和大小。非常强调要认真重视“处理过样品”的正确使用。我将存在于“处理过的样品”与新鲜病人血清间的基质效应看成为第二层次的效应。而且这个效应更为重要。

        现今检验同道似乎对基体效应并不陌生。可是要真正认识，并用于临床检验实践，还有很大距离。有没有认真思考以下一些问题：以往传统的临床化学检验，大多使用无蛋白血滤液，这是为什么？为什么今天都要求使用校准品校准，而不推荐使用纯物质配制的标准液？为什么校准品不能像标准液那样可以任意使用？必须在指定的检测系统上，某个校准品才能为该检测系统校准？既然控制品是采用人混合血清制备的，为什么控制品的结果不能说明检测系统的正确，只能说明检测系统的精密度？为什么现有的检测系统，尤其是免疫项目产品，每换一个批号的试剂，检测结果就会有变化？有的厂商要求必须使用新的校准品定值？

什么是基质？

       基质 (matrix)：在临床检测的分析环境中，除了分析物以外的所有其他物质和组分称为该分析物的基质。因此，“临床检测环境中，除了分析物以外的所有其他物质和组分称为该分析物的基质”，应该包括所有涉及检测的“组分”。检测样品没有试剂的参与，没有校准品的校准、没有分析仪的检测，就没有检测结果。广义上，它们都是检测中的基质。

一、再从基质和基质效应说起

 1、临床检验方法学历史演变 - 以肌酐检测为例。

       许多年来以Jaffe反应检测肌酐。Jaffe在1886年观察到在碱性条件下肌酐与苦味酸反应形成红色。该反应以他名字任命，已经经历了132年检测的年代。1904年，Folin应用Jaffe反应检测尿液的肌酐。可是，从Folin应用起，至今还没有弄清楚：究竟肌酐与碱性苦味酸是怎样反应的！即：肌酐的Jaffe反应只是一个现象的描述，不是什么反应原理！所以，肌酐的Jaffe反应没有检测原理。

 2、检测血液内肌酐碱性苦味酸

       最近，美国临床化学杂志上刊登纪念吴宪前辈的文章，说出了很多以往不知道的内情。原来吴宪为了获得博士学位，拜了Folin为导师。他的博士论文题目就是建立检测血液中的肌酐、葡萄糖等分析物。经过吴宪的研究努力，开创了使用钨酸沉淀全血内所有的蛋白沉淀，然后用滤液进行肌酐、葡萄糖等分析物的分析。这项工作发表在生物化学杂志上，Folin为第一作者。因为当时发表文章必须将导师为第一作者。因此，以后这个钨酸沉淀方法，被大家说成Folin-Wu方法。这篇纪念吴宪文章说，假如这项工作在现在发表，那么应该成为Wu-Folin了。这个做法，在很长的时间内成为临床化学进行很多分析物检测的经典。

       但是，也因为如此的前处理，无蛋白血滤液去除了血液中的所有蛋白，再进行Jaffe反应时，肌酐受到蛋白干扰或基质影响的基质效应大致上是没有的！所以，检测直接使用纯肌酐配置的肌酐标准液为标准，比色检测和计算标本中的肌酐含量。

       肌酐检测方法从国外引入国内。我1965年开始接触检验的时候，全世界无一不使用无蛋白血滤液进行肌酐、葡萄糖和尿素（氮）的检测。没有任何现在遇到的实验室间检测结果不一致的严重问题。因为，方法学一致。当时检验界知道结果是否对，先看肌酐标准液准不准，然后看你的无蛋白血滤液做的好不好。以两个方法学或两个实验室结果的比较，可以确定有无问题。因此，方法学比较很早被检验界认识和使用。

 3、直接使用血清的肌酐检测方法

       在上世纪的70年代，受国外自动化的冲击，国内开始接受直接使用血清或血浆，不要进行无蛋白血滤液的处理，即可进行碱性苦味酸反应的比色测定的方法。很快，这样的肌酐方法在国内普遍采用。由于没有任何质量控制，也没有考虑与以往的无蛋白血滤液结果是否符合。很快推开了。以后，为了避免这样的肌酐检测方法受很多“假”肌酐的干扰，而提出速率法的检测等。但是这些方法依然没有考虑使用纯肌酐标准是否对检测结果的可靠性影响。这样的检测方法学在上世纪90年代出版的书籍中依然这样写！今天的肌酐检测中，遇到的所谓“假性肌酐”的色素问题是自动化要求肌酐直接检测引入的！

 4、基质和基质效应-从上世纪80年代我开始意识到“基质效应”

       早于1985年，我在生产控制血清中发现将纯肌酐配制于透析后的人血清（经透析后已不存在肌酐）内；为了解配制的可靠性取样检测，发现检测的肌酐量明显低于计算的预期量。经回收实验证实，认为肌酐方法的回收率“有问题”。为什么采用纯标准液为标准，检测具有血清为基质的样品，经常得不到回收100％的结果？当时使用的就是肌酐碱性苦味酸的直接测定方法。多次实践我懂得了：要使血清样品的检测结果准确，应该将标准物质配制于血清中为标准。在检测时，同时检测加过与未加过标准物质的血清。将加过与未加过标准物质的检测信号相减，即为添加的标准物质在血清中的真实检测信号。以该实际反映的响应信号大小去估计样品内的肌酐含量，这样的结果才是可靠的。但是，是检测方法对检测的干扰、还是血清内的什么造成了结果的差异，当时还不知道这就是“基质效应”。上世纪90年代的一次上海中美临床检验国际会议上，认识了Dr. Fred D. Lasky。他的演讲令我大开眼界，第一次知道了matrix词语。（当时他服务于强生公司）

二、第一层次的基质效应 -标准水溶液与真实样品间的基质差异

       上图说明，现今的临床化学检测，已经从使用标准、测定和空白，转换为校准、测定和空白。

       为什么要将校准替代了标准？以下三个曲线图可以说明问题。

图1、使用肌酐标准液的直接肌酐比色法的碱性苦味酸的显色曲线

图2、将纯肌酐配制于混合血清后，直接肌酐比色法碱性苦味酸显色曲线图。可以看到，这个标准曲线斜率低于标准肌酐的显色曲线。因标准也以混合血清配制，每个肌酐标准液内含有原混合血清内的肌酐。所以显色曲线具有截距。

图3、直接肌酐比色法扣除了混合血清内原有肌酐后的肌酐显色曲线。可以看出含有血清的肌酐显色曲线斜率低于不含有血清的肌酐显色曲线。

       历史上，Folin-Wu等开创了临床化学检验的定量技术。无论是葡萄糖或肌酐等的检验，都毫无例外地必须对全血进行无蛋白处理。当时这些前辈并不清楚“基质效应”。为了克服蛋白等样品中的成分与试剂形成沉淀，无法对肌酐或葡萄糖等进行比色分析。必须使用无蛋白血滤液。其实，从今天对基质的认识下，这就是在检测中，先去除非分析物的“基质”，才能使检测结果可靠。今天，虽然碱性苦味酸的方法可以直接检测血清内的肌酐。但是，这些非肌酐基质的（主要是血清蛋白）存在，一定会影响肌酐结果的可靠性。除了肌酐以外，应该清醒认识到任何项目，样品中相对于分析物的非分析物（基质）都会对检测结果有基质效应，只是影响大小而已。

       直接肌酐比色法在实践中。至少认识到，今后不应再使用纯物质配制的标准液校准检测系统。因为，纯标准液和病人标本间的基质差异。最好使用混合血清作为“标准”，校准检测系统。以这样的方式可以对大多结果“正常”的标本内非分析物的基质效应予以抵消。但是，危重病人标本的基质状态与“正常”标本的基质状态有着非常显著的差异。因此，相对而言，基质效应无法完全消除。

       还有，标准液是采用纯物质配制的，内含分析物浓度是可以计算出来的。若采用病人混合血清为“校准品”，其内含的分析物浓度无法配制计算而得。必须依赖检测系统的检测。因此，校准品的定值一定与检测它的检测系统关联。所以，校准品不是标准品，它对检测系统校准，故被称为“校准品”。

       新鲜混合血清至今是最佳校准品。可是，无法长期保存。

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