FDA新冠突变检测试剂盒指南之二：对分子诊断试剂盒开发者的建议

 下面的建议旨在供已获得EUA的SARS-CoV-2分子、抗原和血清学检测的开发者，其检测属于FDA指导《Policy for Coronavirus Disease-2019 Tests During the Public Health Emergency （Revised）》中概述的政策的开发者，以及其他向FDA寻求COVID-19分子、抗原和血清学检测EUA的开发者使用。

 本指南介绍了FDA在COVID-19公共卫生紧急事件期间评估SARS-CoV-2新出现的和未来的病毒突变对COVID-19试验的潜在影响的建议。其中有对尚未授权的试剂盒开发商的建议（如关于试验开发和EUA申请），也有对已授权试剂盒开发商的建议。FDA将继续根据现有资料重新评估和适当更新这些建议。

 我们注意到，FDA正在考虑是否在测试EUA中为试剂盒开发者加入一个或多个与评估病毒突变对测试性能影响有关的授权条件，包括与本指南中讨论的一些建议有关的条件。如果FDA这样做，试剂盒开发者将被要求遵守这些条件。

 在FDA对COVID-19试验的EUA请求进行审查期间，FDA打算考虑该试验在所有已知变异中的性能，以及开发者的授权后监测计划。FDA建议试剂盒开发者在其EUA请求中解决标签是否应包括说明用于测试评估的临床标本收集的时间段和地理位置的声明或限制，并指出临床性能在所有流通变异体中尚未确立，性能可能因患者测试时流通的变异体及其流行程度而不同。

 FDA将与之前授权的试剂盒开发商合作，以确定这些测试的授权标签是否需要这样的声明，或其他更新。

 对于《Policy for Coronavirus Disease-2019 Tests During the Public Health Emergency （Revised）》中描述的提供给临床使用的检测，FDA建议检测开发者考虑之前描述的因素，并在检测标签中加入适用于其检测的此类声明。

 FDA还打算酌情向相关人员传达有关病毒突变对COVID-19检测的影响的相关信息，如在安全警示中。

A. 对分子诊断试剂盒开发者的建议

由于诊断测试的性能可能会受到病毒突变的影响，FDA建议研发人员：

（1）设计他们的测试，以尽量减少病毒突变对测试性能的影响；

（2）定期监测可能影响测试性能的病毒突变；

（3）如上所述，在测试的标签中明确传达任何测试限制。

这些建议将在本节中详细解释。

 虽然新变异的病毒基因分型检测可能有助于监测SARS-CoV-2病毒突变的传播，但临床上是否需要这种检测来管理患者的护理仍是未知数。针对和检测特定已知变异体的检测可能会有以下效果

 随着病毒的不断变异，它们很快就会过时。因此，FDA认为，目前全基因组测序测试可能最适合基因分型检测，因为它们能够检测已知和新出现的突变和变异。FDA建议测序测试的开发商在申请EUA时，应尽早与FDA进行讨论，并提出基因分型的要求。

1. 将病毒突变影响降至最低的设计考虑因素

 对于分子测试，FDA建议开发者在考虑其测试设计时，考虑其测试在所有已知变异中的性能，以及未来基因变异的潜在影响。将冗余设计到测试中，可以防止未来变异影响测试性能。具有多个目标的测试和适当的结果解释标准已经被用来识别病人样本可能包含变异的信号，应该用额外的测试和/或病毒基因组测序来跟进。

 FDA 建议试剂盒开发者在其 EUA 请求中包括描述他们如何评估其在目标区域具有突变的所有已知变体的测试性能，并讨论他们的测试设计如何减轻未来病毒突变影响测试性能的风险。

 将一个高度保守的泛SARS-CoV靶点（与冠状病毒科Betacoronavirus属中较大的Sarbecovirus亚属相关的部分遗传密码中的一个靶点，而非SARS-CoV-2的特异性）作为多靶点检测的一部分，可能会提高新的遗传变异的性能；但是，检测中靶点的数量应该是适当的，以提供弹性（即减少病毒突变影响检测性能的风险），并最有效地利用开发者和实验室资源。当使用高度保守的靶点与SARS-CoV-2特异性靶点结合使用时，可能需要进行适当的结果解释，如当泛SARS-CoV靶点为阳性而SARS-CoV-2特异性靶点不为阳性时如何解释结果，以及对总体阳性结果与个别基因阴性结果的后续建议。

2. 对可能影响分子诊断测试性能的病毒突变进行常规监测

 试剂盒开发者应评估以显著频率观察到的变异和突变对其分子诊断测试的潜在影响，以及在有流行率上升迹象的较小比例人群中检测到的那些病毒突变的潜在影响。

 FDA特别建议，分子检测试剂盒的开发者应定期将其引物/探针序列与公开的SARS-CoV-2基因组（如GISAID数据库中的基因组）进行序列比对，以确定突变可能影响检测性能的程度。如果在检测的引物和探针的靶区发现任何突变（如果检测使用替代扩增方法，则为等效的突变），开发者应考虑以下几个因素。

（1） 序列错配在引物/探针内的位置；

（2） 多个序列错配是否会影响一个试验；

（3） 错配的总和是否会影响一个试验的性能。

 突变可能会影响到某一特定测试，使其性能比先前确定的性能降低5%或更多（如授权测试的授权文件中所反映的），或使测试的性能降至SARS-CoV-2分子诊断测试适用的EUA模板（s）中的性能建议以下，如FDA在《Policy for Coronavirus Disease-2019 Tests During the Public Health Emergency （Revised）》第六节中所讨论的。FDA打算修订适用的EUA模板，以包括监测序列数据库的信息和建议，FDA打算随着数据库的改进和更系统地收集病毒序列，更新EUA模板。

 由于病毒基因组的突变会影响检测试剂与SARS-CoV-2的杂交，FDA建议，当检测开发者发现预期会导至目标引物/探针结合位点错配或错配的突变时，评估杂交变化。对杂交影响的调查可以分三个阶段进行，每一个阶段都比最后一个阶段提供更准确的测试性能评估：硅片计算、基因组材料的湿测试和带有突变的病毒分离物的湿测试。FDA建议开发者调查相应的病毒突变可能赋予测试性能的影响，并在其EUA请求中（如果在EUA前进行）或在EUA补充请求中（如果在EUA后进行）向FDA提供以下信息。

（1） 用检测的引物和/或探针与带有和不带有有关突变的病毒靶标进行熔化温度（Tm）计算的结果。Tm是一种提供DNA或RNA杂交信息的计算方法。当序列中引入突变时，如果DNA/DNA或DNA/RNA双联的稳定性降低，Tm就会降低。FDA建议使用能反映试验条件的离子浓度和引物过量等条件来进行这种计算。FDA建议提供计算Tm的方法的说明。

（2）分析确定熔化温度如何变化为盐和引物浓度变化的函数。

（3）对突变可能影响试验性能的可能性进行分析并说明理由，并评估对试验效益和风险的影响；以及

（4）根据开发者的分析结果，说明采取或不采取任何行动的理由。

 根据分析结果，开发者应确定有关突变是否有很大的可能性影响其测试的性能，如Tm降低到测试的退火温度或低于退火温度，或与已知或可疑假阴性相关的突变表明测试的性能降低到适用的EUA模板中的性能建议以下如果有，FDA建议用带有该突变的临床样本进行湿法测试（如果有）。如果无法获得，由于潜在的困难，FDA建议用带有突变的临床样本进行湿法测试。

 识别和获取这样的样品，FDA建议使用合成的RNA靶标，有和没有突变。测试应以类似于典型的检测限（LoD）研究的方式进行，在该研究中，限制性稀释液并行测试，并为两个合成靶点建立LoD。

 如果发现LoD相差>3倍，且该试验尚未获得授权，FDA建议开发者的EUA请求包括对观察到的性能下降的风险分析，以及对任何进一步风险缓解的描述和理由，或者，如果开发者认为不需要缓解，则说明已知和潜在利益大于已知和潜在风险的立场。

 对于已经授权的测试，如果发现LoD的差异大于3倍，或者试剂盒开发者以其他方式发现病毒突变，有可能改变其产品的收益-风险状况，FDA目前的建议是，试剂盒开发者在补充EUA请求中通知FDA，包括对观察到的敏感性降低的风险分析，以及对任何进一步风险缓解的描述和理由，或者，如果开发者认为不需要缓解，则说明已知和潜在利益大于已知和潜在风险的立场。

 如果FDA提出要求，试剂盒开发者应及时向FDA提交建议评价的记录，以供审查。FDA可要求进行额外的研究和/或数据分析，以解决试剂盒开发者或FDA（如通过FDA的监测计划）关注的问题。

 如果FDA要求评估特定突变或变异的影响，FDA期望授权测试的试剂盒开发者及时进行所要求的评估。FDA希望试剂盒开发商和FDA之间能就这些研究、研究设计和/或数据分析，包括向FDA提交资料的时间表达成一致。例如，FDA可能要求使用来自参考基因组的靶序列（即完全匹配靶序列）的定量合成RNA或定量体外转录物的限制性稀释液建立LoD。

 此外，如果FDA通过我们的监测工作发现有关授权分子诊断测试的信号，FDA将联系试剂盒开发商，并期望开发商调查所发现的病毒基因组突变对其测试性能的影响，并及时向FDA提供调查的信息。

 如果发现对授权试验性能的潜在影响，FDA打算与试验开发商合作，解决这些问题，例如更新其标签，以反映其试验性能的潜在变化，或在必要时考虑对试验进行修改。FDA还可酌情采取其他行动，如撤销欧盟许可证。