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【参考物质】体外诊断试剂参考物质的现状与发展

2021-1-3 17:02| 编辑: 小桔灯网| 查看: 2806| 评论: 0|来源: 体外诊断POCT论坛

摘要: 参考物质(Reference Material,RM)是临床诊断体系的重要组成部分,主要应用于测量装置的校准、测量方法的评价、样本的赋值和质量的控制等工作。体外生物诊断试剂是指血型、组织配型、微生物抗原、抗体、核酸、肿瘤标 ...



参考物质(Reference Material,RM)是临床诊断体系的重要组成部分,主要应用于测量装置的校准、测量方法的评价、样本的赋值和质量的控制等工作。体外生物诊断试剂是指血型、组织配型、微生物抗原、抗体、核酸、肿瘤标志物类、免疫组化类、人体组织细胞类、人类基因检测、生物芯片类和变态反应诊断类等体外诊断试剂。对于体外生物诊断试剂而言,参考物质对保证检测结果的准确性和产品的质量控制意义重大。结合国内外发展现状,对体外生物诊断试剂参考物质的特性、研究现状以及进展进行了阐述。

1 ,体外诊断试剂参考物质简介

wH0是世界上体外生物诊断试剂参考物质的主要提供商,长期致力于高品质的国际参考物质(International Standard,IS)的研发工作和RM相关管理法规与技术指南的制定和修订,为各国提高体外诊断检测体系的准确性和可靠性提供支持。在其已经发布和正在研制的IS中,大约95%由英国国家生物制品检定所(NationalInstitute for Biological Standards and Control,NIBSC)提供。WHO通过定期举办体外生物诊断试剂研讨会,对现行的体外诊断试剂管理方法进行讨论并发布新一代Is,旨在采用更高的标准规范体外生物诊断试剂Is的授权和生产过程”,研制出适应于世界各国使用的高质量国际参考品。


2,体外诊断试剂参考物质的共性和特性

ISO 17511中规定体外诊断试剂参考物质(主要是生物制品)应具有以下特征:追溯性、不确定性和可替代性等。此外,FDA于1999年将遗传学检测纳入体外诊断试剂的检测范围。生物大分子如乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis B SurfaceAntigen,HBsAg),基因型的同一性也是这类体外诊断试剂RM必须具有的特性属性。

参考品的追溯性和不确定性在很多文献中都已进行了详细的讨论,然而作为生物类RM,还存在一些特性。生物分子具有的生物学活性,会随着外界物理化学环境、实验人员和实验方法的改变而改变。科学家不能用哪一项指标或者哪几项指标去计算或校正实验中的不确定性,这使得实验结果的追溯性变得异常复杂,这也给测量

方法的选择制造了很多困难。研究员要摸索不同的实验方法和实验条件参考大量的文献和实验数据,才能得到一种相对可靠的方法,计算不确定度。因此,选择一个合适的检测平台,减少RM换代频率,是确保临床检测结果稳定性的重要因素。


3,体外诊断试剂参考物质举例

以下选择了WH()提供的几大类具有代表性的参考物质为实例进行介绍。

3.1 传染病相关标记物

3.1.1 乙型肝炎病毒表面抗原国际参考物质乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis B SurfaceAntigen,HBsAg)参考物质(NIBSC编号:03/262),来源于英国,是乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)临床中重要的诊断项目。HBsAg国际参考品为乙型肝炎病毒分析试剂提供灵敏和准确的分析标准,应用于ELISA检测试剂盒和一些快速检测方法对A2基因型HBV病毒进行检测。在世界很多地区,A2基因型致病十分普遍,但在一些发展中国家和地区,其他基因型患者的比例远远高于A2型患者,这给当地检测工作增加了很多困难。WHO推荐各国的相关管理部门根据本国现状,对试剂盒所能检测的基因型和亚型进行筛选(见表1)。

各国检测机构在使用HBsAg国际参考品,用于乙型肝炎病毒表面抗原试剂盒灵敏度的评估。目前,WHO发行的IS包括:HBsAg表面抗原、DNA和相关质控品等。新一代IS将取代欧洲委员会技术指导原则中使用RM用于体外诊断试剂体系的临床检测。

WHO对于HBsAg国际参考品的描述如下:


溯源性:WHO协作标定中心于1975建立了包括独立的HBsAg参考血浆在内的第二代HBsAg国际参考品,第二代IS曾被用于第一代IS的协作标定工作。第二代参考血浆和第一代IS都已经被独立储存了超过30和23年(截至2004年)。经过实验检测,第二代HBsAg IS与第一代产品并无差异,可以确定HBsAg国际参考品的特异性免疫反应效价没有改变。

连续性:通过WHO协作标定中心数据表明,分别使用10套第二代I-msag IS与10套第一代IS进行对比,实验结果十分相近,说明两代IS有很好的延续性。

不确定性:WHO数据表明,不同检测试剂盒测量不确定性内部偏差受多种因素影响,但主要取决于生产检测试剂盒使用的特异性抗体。

可代替性:通过实验对多份第二代参考血制品进行比对,结果表明,它们的各项指标的变化范围非常小,可以相互替代。

基因型:通过对市面上绝大部分商业HBsAg试剂盒进行评估,发现它们对非A2基因型乙型肝炎病毒都不敏感。

3.1.2 丙型肝炎病毒国际参考品

第四代丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)国际参考品(NIBSC编号为06/102),来源于英国。应用于体外诊断试剂的生产、质量控制、参考标定以及实验室检测和输血中心的比对工作。IS使用标准化的基于核酸扩增技术(NucleicAcid Amplification Technology,NAT)的HCV检测方法。WHO国际参考品包括了HCV 1a基因型阴性抗体和阳性RNA血浆。效价应用国际单位(International Units,IU)表示,与第二、三代HCV国际参考品有良好的连续性(见表2)。

3.1.3艾滋病病毒一1型国际参考品HIV一1国际参考品包括HIV一1 p24抗原、RNA以及相关溶剂等。HIV一1 p24抗原(NIBSC编号为90/636),来源于英国和美国。它适用于ELISA方法对HIV一1病毒的P24抗原进行诊断。p24抗原IS为冻干粉末,使用PCR方法检测HBsAg、anti—HIV、anti HCV和HCV RNA均为阴性。每瓶含量为1000 IU,其中含有6 mg由HIV一1型患者血清中分离的白蛋白(见表3)。

3.1.4 第二代细小病毒B19国际参考品第二代细小病毒B19国际参考品(NIBSC编号为99/802),来源于英国,用于体外诊断试剂核酸分析。本品直接来源于人类器官,对HCV RNA、HAV RNA、HIV RNA、HBV DNA、HBsAg、anti—HCV和anti—HIV成阴性反应(见表4)。

3.1.5人源性梅毒血浆国际参考品

(1)第一代人源性类梅毒血浆IgG/IgM国际参考品(NIBSC编号为05/132),来源于南非。它可被用作梅毒螺旋体荧光抗体试验、梅毒螺旋体明

胶凝集试验和IgM/IgG酶联免疫试验的对照品。

(2)第一代人源性梅毒血浆IgG国际参考品(NIBSC编号为05/122),来源于英国。本品用于梅毒螺旋体血凝实验检测的校准,并可以作为梅毒螺旋体荧光抗体试验和IgG酶联免疫试验的阳性对照。上述两种IS的换算关系:0.3 IU单位的05/122相当于1 IU单位的05/132。

3.2 血制品国际参考物质

3.2.1 第八代WH()人源性凝血因子Ⅷ第八代wH()人源性凝血因子Ⅷ(NIBSC编号为07/350),用于辅助甲型血友病等相关血液疾病的临床筛查。wH()对血浆凝血因子的校准工作建立了严格的国际标准,血液产品的各项指标必须符合规定。尽量选用同质同源的RM,降低血制品中凝血因子测定不确定性水平,通过各种不同方法的检测,将不确定度控制在较低水平(4%~8%)。收集人员对血液的收集和血库的组成有明确的规定(如:不同的年龄、性别、血型以及用药情况等),可以反映正常人群情况。

WHO对凝血因子的参考物质的规定:

可追溯性:每1 mL“正常人血浆”具有功能的活性物质的含量,可追溯到原正常人血浆。

连续性:尽量减少供应血源的人群波动性,对新鲜血制品进行标准化检测。

不确定性:使用相同的或者相似的血源替代时,显著差异不能超过2%~5%。

凝血因子是一种寿命比较短的分子(大概5~8年), 主要是通过血浆提取而获得的。在发达国家,即使是重组的凝血因子Ⅷ都是治疗甲型血友病的首选药物。血液病毒灭活操作和凝血因子提取过程对凝血因子效价影响很大,对不稳定的凝血因子Ⅷ的影响更大。为了更好地保持凝血因子Ⅷ活性,必须优化提取的全过程,从而将损失降到最低量。实验表明,对原料血浆的冻存时间和温度进行有效的控制可以最大限度地保持凝血因子活性。欧盟药典对于血浆中不稳定成分的冻存方法的描述,只提及了在收集血浆24 h内冻存到一30℃,并没有其他规定。欧盟的指导原则建议将收集的血浆在1h内冻存到30℃或者低于-30℃,从而确保血浆中心温度到达--30℃水平,跳过-23℃的血浆凝固点。在血浆捐赠的4 h内冷冻最适合于凝血因子Ⅷ活性的保持。在冻存过程加入2%(w/v)NaCl可以有效地保护血浆度过凝固点。同时,提高冰前速度或者冻存速度以及使用宽窄适当的冻存盒存放血浆都是非常重要的。冰前速度达到或者高于26 mm/h时。仅仅包装边缘的凝血因子活性会降低或者消失,而冰前速度低于9 mm/h时,凝血因子活性含量会显著下降。实验推荐的冻存时间为小于等于60 rain。

3.2.2 抗A抗B血型wHO参考试剂(人血清)正常(人血清)静脉注射免疫球蛋白抗A抗B国际参考试剂(NIBSC编号07/310),来源于英国。它是血凝标准化试验以及抗A和抗B在正常静脉注射免疫球蛋白(Intravenous Immune Globulin,IVIG)产品的特异性质控品。参考品07/310的浓度被视为阈值浓度。当“IVIG的抗A抗B含量”高于07/310时,称为阳性试样,编号为07/306;当“IVIG的抗A抗B含量”低于07/310时,称为阴性试样,编号为07/308。该项参考试剂的国际认可工作已在NIBSC、欧洲药品质量和健康管理局、美国生物制品评估研究中心/美国食品药品管理局协作研究完成(编号:BSP089)。

3.3 促凝血酶原激酶国际参考物质 

促凝血酶原激酶用于临床患者血凝的时间值的测定,可用于血栓栓塞疾病的临床检测。作为WHO二级参考物质供全球范围使用。血栓栓塞患者在临床治疗时用促凝血酶原激酶试剂检测抗维生素K的口服抗栓治疗效果,用国际敏感指数(International Sensitivity Index,ISI)表示该结果。目前,WHO有3种促凝血酶原激酶的参考物质,分别为牛源促凝血酶原激酶(OBT/79)、兔源促凝血酶原激酶(RBT/90)和重组人类促凝血酶原激酶(rTF/95)。其中,RBT/90和OBT/79很少被使用了。欧盟也有2种促凝血酶原激酶参考品,即牛源促凝血酶原激酶(ERM-ADl48)和兔源促凝血酶原激酶(ERM—ADl49)[2,14-18]。

WHO对促凝血酶原激酶参考品有如下要求:

溯源性:WHO要求牛源和兔源的促凝血酶原激酶参考物质同人源参考物质一样,都具有良好的可追溯性,ISI由wHO协作标定。

连续性:新产品与前一批参考品有良好的连续性,对稳定性的研究要附加实验数据。

不确定性:wHO的多个医学研究中心通过协作标定,确立新一代促凝血酶原激酶国际参考品ISI值的不确定性。

由上文可见,促凝血酶原激酶的长时间稳定性和ISI值受到广泛关注。科研人员将兔源促凝血酶原激酶ERM—ADl49(EC)和RBT/90(WHO)在规定条件下监测6年(1996~2002年),ISI值没有显著变化。同时,使用欧盟的参考物质ERM—ADl49和牛源促凝血酶原激酶(OBT/79)分别在11个和9个医疗研究单位进行监测(1994~2005年),也没有显著性差异。从而认为:在6年或更长时间内,WHO和ERM所提供的参考品的稳定性和ISI值没有发生显著变化。

3.4 激素和其他蛋白类参考物质

激素由生物体特定细胞分泌的一类调节性物质,对肌体的代谢、生长、发育、繁殖等起重要的调节作用。由于激素类RM种类众多,需要不同的“参考方法”进行管理。下面以促甲状腺激素和人绒毛膜促性腺激素为例,介绍一下WHO对激素类IS的管理规范。

促甲状腺激素(Thyroid Stimulating Hormone,TSH),NIBSC编号为94/674,来源于英国。目前,TSH试剂盒已经广泛地用于临床检测,但是其在患者血浆中的组成目前尚不清楚。一些国家(如荷兰和德国)对于临床TSH参考品使用与WHO存在一定差异。研究表明,TSH蛋白不同部位的糖基化水平的不同,是导至检测结果差异的重要原因之一。

人绒毛膜促性腺激素(Human ChorionicGonadotrophin,hCG),NIBSC编号为99/688,来源于英国。目前已经分离确定了6种相关蛋白质,其组成比例是经过氨基酸分析确定的,用mol单位标定J。也就是说hCG产品可以溯源到国际单位(SI单位制)并且可以用不确定度评价。由于它的特殊性,

hCG国际参考品不在WHO定义的生物制品中。

总之,激素类国际参考品既可以用于急性疾病的诊断,也可以用于监控临床治疗后患者的恢复情况。

由于它们品种繁多,难以统一管理,WHO推荐按照IS本身特点从以下几个方面进行评估:

追溯性:对于TSH来说,新标准的IU取代了上一个标准的IU,追溯性也是指新一代IS的性质。对于hCG参考品来说,可通过确定的参考检查方法(氨基酸分析)将其追溯到sI单位。

连续性:以TSH为例,WHO使用多种方法对产品进行定值,但方法间的误差很大的时候,哪一种方法更为精确很难达成共识。

不确定性:以TSH为例,当新一代IS有足够的蛋白分析数值取代了上一代IS的数值时,原IS的赋值就不再使用而被新的Is赋值所取代。在这过程中并没有涉及到不确定度。但是对于hCG来说,由于有确定的氨基酸分析方法进行标定,也就是说可以得到相对确定的不确定度。

可代替性:由于不同的IS采用不同的分析方法。WHO希望通过IS特性进行检测并采用可以接受的WHO指定的计量方法进行测定。


4,我国体外生物类诊断试剂参考物质现状

4.1诊断试剂参考物质的管理

在我国,国家药品、医疗器械(包括体外诊断试剂)等标准物质的研究、方法和管理工作由中国食品药品检定研究院(简称:中检院)负责。中检院成立了专门的国家药品标准品委员会(包括医疗器械)负责对标定的标准物质从原材料选择、制备方法、标定方法、标定结果、定值准确性、量值溯源、稳定性及分装与包装条件等资料进行全面技术审核,并作出可否作为国家药品标准物质的结论。具体流程见图1。

4.2 已建立的体外诊断试剂参考物质

目前,中检院已经可以对外提供的体外诊断试剂参考品达120多种,涉及了我国常见的、危害较大的各种传染病,如HIV、HAV、HBV、HCV、HPV、结核分枝杆菌、甲型H1N1流感病毒和EV71病毒等。依据各种体外诊断试剂的特点,所建立的参考品适用于酶标法、荧光和化学发光法、荧光PCR检测技术等多种检测方法。同时针对不同的病原微生物的特点,分别建立了抗原、抗体、核酸等参考品。此外中检院还建立了30余种肿瘤标记物、激素、多肽和基因多态性检测参考品。各种体外生物诊断试剂参考品的建立为科学规范地进行产品注册和审评提供了技术支持,也为上市后监督抽验提供了质量保证。 


5, 结论

本文着重对体外生物诊断试剂参考物质进行介绍,详细介绍了WHO已经拥有的或者正在研发的传染病相关标记物、血制品、激酶类以及激素类等四大类体外生物诊断试剂常用参考品,概括起来,对RM管理有以下特点。

5.1国际组织管理的参考物质种类多、有交叉现象并且管理标准有一定差异 。

WHO、FDA以及其他授权的参考物质生产商对RM的生产和管理都有各自的管理要求,并且很难达成统一的管理意见。

这主要有以下原因:

①生物类RM的地区特异性高。由于致病基因的氨基酸偏好性等因素的影响,不同地区对相同疾病的确诊结果有时难以达成共识。同一种RM在不同地区检测相同疾病的灵敏性也存在差异;

②不同国家,由于相同疾病的人群发病率差异性很大,使得各国政府对不同参考物质的管理办法也不同;

③不同国家不同实验室、实验人员以及实验条件存在很大差别,即使是使用相同检测方法检测相同基因型,所得到的结果也很难具有可比性;

④出于政治和经济因素的考虑,各国政府都会在一定程度上利用本国的参考物质政策限制其他国家体外诊断试剂产品的进口。以上原因都是国际间在参考品管理和审批中很难达成共识的主要因素,特别是在高危体外诊断试剂参考品的管理和审批过程中。在我国体外诊断试剂注册检验中,在有国家参考品的情况下,企业申报产品要优先选用国家参考品;若没有国家参考品时,可以选择国际参考品进行检测实验;若以上两种都缺失,才可以选用企业内部参考品进行检测。

5.2 由于生物类参考物质的不确定性受多方面因素影响,很多困难有待解决。

由于生物类参考物质多数是大分子,分子各相极性差异很大。虽然WHO对每类RM的赋值都是授权多个水平相当的权威实验室,采用多种检测方法对产品的不确定性进行评估。但是,由于不同检测方法的误差(非随机误差)偏向性不同,各方面误差对产品不确定性的贡献难以确定,所以很难

将所得数据进行简单的数学处理得到不确定性值。

此外,生物分子的不稳定性也给不确定性的赋值增加了困难。在我国,体外诊断试剂参考物质的研制同样存在交叉现象,药品监督管理部门、临床实验室管理单位以及部分科研院所和试剂生产厂商均参与制备体外诊断试剂的参考物质,这使得参考物质的种类日益丰富,但同时也暴露出多头管理和参考物质品种不平衡的现象。为促进参考物质的研发,各研制单位应加强合作,努力消除参考物质的管理和研发中的差异,不断增加体外诊断试剂参考物质的品种和质量,促进诊断试剂行业的科学和谐。

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