(一)实现自动化面临的挑战
1.样本前处理复杂:临床生物样本的组成成分往往比较复杂,如临床检验中常用的血清样本,含有蛋白质/多肽、糖类、脂类、核酸类、无机盐、氨基酸、激素类、维生素、有机酸以及微量元素等,质谱仪器的高灵敏度,需要对样本进行前处理,分离净化待测组分,去除干扰组分等。不同的样本类型,不同理化性质的分析物,以及含量高低(如健康成年女性血清中葡糖糖含量为g级别,而雌二醇含量则为pg级别)等需要选择不同的样本前处理方法,同时需要对样本前处理方法进行优化,包括萃取方式,萃取试剂(和/或不同萃取试剂比例),萃取时间等,有些被测物还需要经过衍生化,对衍生化条件又需优化和选择,样本前处理方式的复杂要求,可供使用商品化试剂盒较少,往往需要手工操作,给临床自动化检测带来困难。
2.色谱-质谱检测参数个性化:色谱-质谱仪针对不同的被测量需要单独优化和使用检测参数,如色谱柱品牌/类型、流动相种类、比例、流速和分离梯度等;质谱仪的碰撞电压、去簇电压、聚焦电压、摄入电压、碰撞能量、离子化温度以及雾化气、气帘气、碰撞气等,且不同品牌的质谱仪检测参数也存在很大差异。LC-MS/MS技术相较于生化/免疫分析方法尚需要手工操作,且要求批量分析,难以实现紧急样本的随机插入检测,且报告周期较长(至少需要1个工作日),无法满足临床样本量较少且需快速报告结果的项目需求。以上要求均限制了质谱检测的自动化发展,无法像生化流水线一样批量快速样本处理和检测。
(二)技术上面临的挑战
1.离子抑制:离子抑制(或离子增强)[33]是LC-MS/MS技术特有的一种“基质效应”。质谱的检测对象为离子,因此样本中被测物均需转变为带电离子,被测物离子化程度越高、形成的离子数量越多,质谱检测到的物质就多。在检测被测物的过程中,若存在大量其他离子时,且液滴表面离子过于密集,样品中被测离子不能到达液滴表面,不能通过离子蒸发模式形成气相离子,样品信号强度响应随着其他离子浓度的增高而降低,即离子抑制。流动相中的添加剂(盐及离子对试剂)、杂质,样品中的盐类、药物、代谢物、蛋白质等均可能影响离子化效率,造成检测结果的不准确。临床样本的类型(血清、血浆、尿液、唾液等)和来源(患者、健康人、不同年龄、性别)往往比较复杂,样本之间可能存在不同的基质效应,因此在方法开发时必须重视和评价。不过随着内标同位素的应用,与检测物往往有着类似的性质,在信号响应足够的情况下,不会对定量检测结果产生很大的影响。如果被测物浓度很低,信号响应不足,则可以通过优化前处理提取条件、衍生化或者优化分离梯度等进行解决。另外质谱无法区分同分异构体,也需色谱进行分离。
2.天然同位素干扰和源内变构:在LC-MS/MS的应用中,稳定同位素内标通常具有与待测分析物完全相同的分子结构,在样本制备过程中添加内标,能显著提高待分析物定量准确性。稳定同位素内标通常应该包含3个或更多稳定同位素原子,否则待分析物含有的天然同位素峰会被计入内标的峰面积从而影响检测结果的准确性。同时在使用氘代内标时还应注意源内变构现象[34],其原因是氘标记的内标在离子化过程中可与分析物发生氢-氘交换,会使得结果假性升高。因此,可以尝试不同标记元素的内标,如15N13C等;还有一些结合型代谢物(如霉酚酸可形成葡萄糖醛酸或者硫酸代谢物)可在离子源离子化过程中裂解,干扰检测,造成假阳性,需色谱分离,消除影响[35]。
3.在生物大分子检测领域应用存在的技术挑战:随着基因组学和蛋白组学的快速发展,越来越多的生物大分子标志物在疾病诊断中广泛应用。近年来,虽然LC-MS/MS技术在生物大分子领域如蛋白和多肽测定中也逐步应用,不断有新项目的检测方法见诸报道,如C-肽、胰岛素、HbA1c、胱抑素C等[36, 37, 38],但仅限于科研,如为临床常规应用,尚需解决一些技术问题。首先,血清/血浆中蛋白种类达上万种,浓度分布跨度非常大,对于低丰度的蛋白检测存在较大困难,需要提高仪器检测的灵敏度和准确度或者使用相关的富集技术;其次,蛋白的分子量通常都比较大,超过LC-MS/MS分析的范围,因此在检测前需要酶解成合适质荷比的肽段定量,增加了样本前处理的复杂度和时间,同时酶解效率等带来很大误差,导至方法重复性较差;再次,蛋白内标和肽段内标以及整个处理流程的经济、时间、人员成本较高;以上均限制了LC-MS/MS技术对生物大分子检测的临床广泛应用。相信随着微量蛋白富集技术、样品自动化处理以及同位素内标的进一步发展,LC-MS/MS技术在蛋白定量上的临床应用会越来越多。
综上,虽然与免疫学方法相比,LC-MS/MS技术具有鲜明的特点和独特的优势,但也还存在自动化程度低、仪器复杂、对操作人员要求高等不足。但相信随着技术的进一步发展成熟和配套试剂盒的开发应用,这些技术瓶颈会被逐步解决,质谱定量技术会在临床中有更广泛的应用。
自20世纪90年代LC-MS/MS技术应用于临床实验室以来,其灵敏、特异、高通量的精准检测结果使得其在临床检验中快速发展,越来越广泛的应用于临床相关疾病诊断[39]。目前该技术在(代谢)小分子领域的应用逐渐成熟,未来的发展方向是在生物大分子(蛋白/肽段和核酸等)精准定量方法的研发应用。虽然LC-MS/MS技术在临床中应用存在一些缺陷,但相关专家正在积极探索,将其向全自动生化流水线发展,并集成到LIS系统中。MS供应商也积极开发更多通用的试剂盒,以帮助减少不同实验室间采用该技术的障碍和可比性问题。建立基于LC-MS/MS方法的参考区间、建立标准化的测量程序、参加室间质量评价计划,研制互通性良好的参考物质,基于LC-MS/MS技术开发商业化的检测试剂盒,将有助于进一步改进LC-MS/MS方法在临床上的应用现状。基于LC-MS/MS技术的检测方法是临床医学诊断的重要组成部分,相信随着技术的进一步发展,必然会在临床检测中有更广泛的应用。