PCR方法—常用的10种策略
2020-11-1 18:54|
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摘要: PCR实验包括三大主要的热循环步骤 ，在这个过程中需要多种必要的反应成分 ，通过对PCR的设置做相应的调整，便可以获得一些特殊的实验结果，如产率提高，特异性增强或反应时间缩短等。表 1.常用PCR方法及其核心优势热 ...
| PCR实验包括三大主要的热循环步骤 ，在这个过程中需要多种必要的反应成分 ，通过对PCR的设置做相应的调整，便可以获得一些特殊的实验结果，如产率提高，特异性增强或反应时间缩短等。 
常用于增强PCR扩增的特异性。该方法主要利用抗体、亲合配体、适体或化学修饰物等酶修饰酶，来抑制室温下的DNA聚合酶的活性。这种修饰使得在PCR体系配制阶段引物与模板、引物与引物之前的结合能力降低，从而避免了非特异性扩增。由于DNA聚合酶在室温下的活性被抑制，所以，热启动技术为在室温下配制多个PCR反应体系提供了极大的便利，且不会影响特异性和扩增能力。当反应体系配制好后，在反应初始加热阶段或“热启动”阶段，酶修饰物在高温下（通常高于90 ℃）被释放，使得DNA聚合酶被激活。具体激活时间和温度取决于DNA聚合酶以及热启动修饰物的性质。对某些DNA聚合酶而言，有时激活和起始变性步骤可以合并为一步。
另一种提高PCR反应特异性的方法是调整PCR循环的参数。在降落PCR中，前面几个循环的退火温度设定为比引物的最高熔解温度（Tm）再高几度。较高的温度有助于避免产生引物二聚体及非特异性引物-模板复合物的形成，因此可减少不希望出现的扩增。因此，在PCR起始阶段提高退火温度，可减少非特异性PCR产物，增加特异性扩增。需要注意的是，虽然较高的退火温度能够防止引物二聚体形成和非特异性引物结合，但同时也可能加剧引物与目的序列的解离，从而降低PCR得率。为克服这一问题，在最初几个循环中，通常会将每个循环的退火温度降低1°C，以获得足量的目标扩增子。一旦退火温度达到或“降落”至最佳温度（通常比最低引物Tm低3-5°C），剩下的循环都维持此退火温度。通过这种方法，在PCR过程中，所期望的PCR产物得到有选择性的增加，同时保证很少或不发生非特异性扩增。巢式PCR是标准PCR的一种演变，其增强了反应特异性和目标扩增子的产量。在此方法中，需要设计两对PCR引物：一对（外引物）在目标扩增区域的侧翼，另一对（巢式引物）对应于待扩增的DNA区域。其中，外引物用于第一轮PCR，以扩增含有延伸侧翼区域的区域。随后，巢式引物用于第二轮PCR，并以第一轮PCR产物为模板。如果第一对引物（外引物）的错配导至非特异性产物被扩增，相同的非特异性区域被第二对引物识别并继续扩增的可能性非常小，所以通过第二对引物的扩增，PCR的特异性得到了提升。进行两轮PCR的一个优势在于：有助于从有限的起始DNA中扩增得到足量的产物。在快速PCR中，通过缩减PCR步骤所需时间来完成更快的扩增，且不会影响扩增产量和效率。快速循环条件尤其适用于具有高扩增能力的DNA聚合酶，这类聚合酶在每个结合中可引入更多的核苷酸。高合成能力 Taq 聚合酶所需的延伸时间仅占低合成能力Taq聚合酶所需时间的1/2至1/3，却能维持较高的扩增效率。此外，如果引物的退火和延伸温度相差无几，则可将它们合并为一步，以进一步缩短PCR时间。这一过程也被称为 两步PCR法。当使用低合成能力的 Taq 聚合酶时，如Taq聚合酶，快速循环条件可能适用于 <500 bp左右的短片段。扩增如此大小的片段通常不需要延长聚合时间，因此可缩短PCR方案中的延伸步骤时间。为确定最短延伸时间，同时又不损失产物得率，可采用一系列延伸时间递减的方式（几秒）优化PCR。每个目的片段和引物对都可能会产生变化结果，所以需要在特定条件下对快速PCR进行优化。快速PCR的另一种调整方式是缩短变性时间，将变性温度提高至98°C。使用这种策略时应注意，非高度热稳定的酶在这种高温环境下易于变性。表 .使用低合成能力DNA聚合酶实现快速PCR时所用的反应参数。
使用可实现快速循环的热循环仪和薄壁 PCR管，分别有助于实现快速变温和高效热转移，从而能够大大加速PCR。直接PCR是指直接从样品扩增目标DNA，无需进行核酸分离纯化。直接PCR中，在高温变性阶段，诸如细胞、组织等材料在特殊的缓冲液中被裂解，释放出DNA。因此这种方法简化了实验流程，减少了动手操作时间，同时可避免纯化步骤DNA的损失。
推荐使用具有高合成能力的DNA聚合酶用于直接PCR扩增。细胞碎片、蛋白、脂质和多糖也随DNA一起被释放到裂解液中，它们会抑制PCR反应。而具有高合成能力的DNA聚合酶能够耐受这类抑制剂，使直接PCR扩增成为可能。具有高合成能力的酶通常具有更高的灵敏度，因此可从未纯化的样品中成功扩增微量DNA。具有高GC含量（>65%）的DNA模板由于G和C碱基间的强氢键影响，比较难以扩增。富含GC的序列同时也涉及二级结构。因此，富含GC的序列可导至DNA聚合酶沿模板扩增时“卡顿”并干扰DNA合成。为了扩增高GC含量的片段，双链模板必须解离，以便引物与模板结合，并使DNA聚合酶能够读取到序列。为了克服强GC相互作用，最常用的方法是使用DMSO等PCR添加剂或辅助溶剂来帮助DNA变性。然而，这些试剂通常会降低引物的 Tm，所以退火温度也需进行相应的调整。高合成能力的DNA聚合酶由于与模板的结合能力更强，有利于完成高GC含量PCR。超高热稳定性DNA聚合酶也有利于高GC含量PCR，因为较高的变性温度（如，使用98°C代替95°C）可能会促进双链解离和PCR扩增。多重PCR可在同一PCR反应管中同时扩增多个不同的片段。多种PCR不仅意味着节省时间、试剂和样品，还能够同时对比多个扩增子。 当一个PCR管中有多个引物对时，如在多重PCR中，因无法仅针对一个引物对或目的片段进行反应优化，而是要考虑到所有引物和靶标，所以可能会出现非特异性扩增和效率降低。因此，为尽量减少由非特异性扩增导至的错配，应对引物进行精心设计。首先，引物序列应尽可能与其目的序列一一对应，并且所有引物的 Tm相差不应超过5°C。在多重PCR开始前，应利用单个PCR反应验证每个引物对的特异性和扩增效率。此外，扩增子应具有不同的大小，从而能够通过凝胶电泳对其进行分离鉴定。除了引物设计和扩增子大小，使用热启动DNA聚合酶和专为多重PCR设计的缓冲液也将有助于获得成功的PCR结果和提高反应特异性。 尽管多重PCR常作为终点法PCR，但由于其在多重标记和检测中的能力 ，将其用于实时荧光定量PCR也变得越来越流行。另外，多重实时荧光定量PCR也常被用于遗传标志物的检测，用于人类身份鉴定。长片段PCR通常是指扩增大于5kb的DNA片段。长片段PCR传统上使用 Taq DNA 聚合酶（用于快速延伸）和高保真酶（用于提高准确性）的混合物。随着具有高合成能力的高保真DNA聚合酶被发明出来，现在能够在更短的时间内实现更准确的长片段PCR。通过在DNA聚合酶中设计一个较强的DNA结合结构域，从而使其能够在短时间内扩增长片段（如，来自gDNA的 >20 kb 片段），实现高合成能力。此外，极高的保真度（如， Taq 聚合酶保真度的 >100倍）还有助于确保长片段扩增的低错误率。
表 .在长片段PCR和克隆中使用高合成能力高保真DNA聚合酶的优势。DNA聚合酶的高合成能力可显著缩短长片段PCR的反应时间（在本例中，时间缩短了一半），而高保真度可减少筛选含正确插入片段克隆的工作量。当扩增>10 kb的目的片段时，应根据以下5个关键点对PCR方案进行优化：2. 如果DNA聚合酶的热稳定性较低，则需要使用更多量的酶，以弥补因延长循环时间导至的活性损失。4. 适当延长PCR步骤的持续时间，有助于模板DNA的完全解离及引物的结合。5. 适当延长PCR延伸时间，可确保目标区域的全长复制。 反向PCR起初设计用于确定邻近未知区域的序列。它有助于研究基因的启动子序列；致癌性染色体重排，如基因融合、易位和转座；以及病毒基因整合。该方法之所以被称为反向PCR，是因为引物设计用于向两边延伸而不像常规PCR中朝着彼此延伸。如今，反向PCR常被用于定点突变，复制一个具有预期突变的质粒。在研究基因组DNA未知序列的传统工作流程中，首先进行限制性酶切消化和连接，再进行反向PCR，随后对PCR扩增子进行测序。对于gDNA消化，需选用一种限制性内切酶进行酶切，以获得长度合适且能够自我连接的片段。同时，选定的限制性内切酶不可剪切已知序列，从而使连接发生于侧翼未知序列之间。使用低浓度的酶切DNA片段优化连接步骤，使其倾向于自我连接而非多片段连接（即形成连环体）。完成自我连接后，从DNA的已知区域启动反向PCR。所获得的扩增子每个末端都含有部分已知DNA序列。随后，可从末端开始对这些扩增子进行测序，检测上述已知序列的相邻区域。序列的扩增程度（得率）取决于模板起始量，PCR常用于对样品中的DNA进行定量，其中，最常见的应用是基因表达定量。终点PCR方法虽然可行，但它存在一重大缺点，即需要通过凝胶电泳确定得率，从而限制了检测灵敏度。此外，定量是在PCR末期进行的，而此时的扩增已达到平台期，因此，DNA凝胶染色强度无法与DNA起始量呈线性相关。尽管如此，若在到达平台期之前通过终点PCR对基因表达进行半定量分析，可使用连续稀释的DNA样品作为起始物，或收集指定PCR循环的扩增子，并根据凝胶染色强度估计基因表达量。 直到1993年，Higuchi等报道称使用荧光信号对PCR扩增进行实时监测，才克服了终点PCR定量的局限性。这一技术为我们今天所熟知的定量PCR(qPCR）奠定了基础。1997年，第一款qPCR仪进入市场，使PCR能够准确定量基因表达和拷贝数。qPCR依靠对指数期目的片段扩增荧光信号的实时监测，克服了终点PCR定量的缺点。尽管qPCR能够定量检测相对和绝对基因表达，但是其检测能力限制了定量性能。20世纪90年代与实时荧光定量PCR同时开发的数字PCR （也称为极限稀释PCR）实现了真正的DNA样品绝对定量。在数字PCR中，是将高度稀释的DNA样品分配到多区室芯片中，使每个区室最多含有一个拷贝的靶标。然后，对每个区室内的扩增进行检测，获得阳性或阴性结果（分别为1或0个模板拷贝；即， "数字" 结果）。最后，使用统计模型（泊松分布），根据阴性反应部分确定样品的拷贝数，无需定量已知样品（标准品）。除了基因表达和拷贝数定量，数字PCR还适用于区分低频等位基因、病毒滴定以及下一代测序文库的绝对定量等应用。利用数字PCR进行绝对定量的一般工作流程。 总之，改进的PCR实验方案和改进的DNA聚合酶旨在改善PCR扩增的结果。虽然PCR的基础概念并未发生改变，但新型PCR方法将继续推动和简化分子生物学研究。 |
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