测序技术是单基因遗传病诊断应用的主要技术，针对检测基因的范围可大体分为单基因检测技术和多基因检测技术。单基因检测是指针对某一特定基因进行测序的技术，适用于具有特异疾病表型的疾病。单基因检测技术中应用最广泛的是Sanger测序，也称一代测序。Sanger测序因仅能检测一个或少数几个基因，因此适用于明确可识别的特异性表型的疾病诊断。多基因检测技术主要是NGS测序，也称二代测序。可以对基因组的成百上千个基因、甚至全部人类基因进行大规模的平行测序，同时对产生的数十万至数百万的数据进行同时读取。常有人把一代测序和二代测序比喻成“钓鱼”和“捕鱼”。
Sanger测序的优势是成本低、覆盖度高，对于目标非常小的测序任务，如验证某一个位点的变异，或者检测几个外显子，则非常适用。其次准确性相对高，准确率可以达到99.999%。第三检测周期相对短，只需要2至4周就能得到检测结果。Sanger测序最大的应用局限性就是通量低，只能对一个或少数几个基因变异导至的高度特异的临床表型进行确诊。其次是灵敏度低，Sanger测序是以峰图形式呈现，用于检测纯合或杂合变异，但是对于检测样本中体细胞嵌合体、线粒体DNA等低丰度变异则无法检测到。另外Sanger测序只能对特定基因进行检测，有可能检测到意义未名的变异（Variants of Unknown Significance，VUS），但无法实现新致病基因的科研发现。
今天隆重介绍的就是当下测序的主要检测技术——高通量测序（Next Generation Sequencing，NGS），该技术可以实现多基因大规模平行测序，可以从根本上解决单基因遗传病因异质性、基因多、表型复杂造成诊断难的实际问题。NGS实验流程是一个文库制备→芯片捕获→测序→数据分析的过程，基于NGS测序技术有三类检测方案：
一、NGS-目标疾病类捕获方案（Panel方案） Panel检测是针对某一特定类别疾病的相关基因，如下图-中图：
Panel检测适用于以下几种情况： （1）基因研究清楚的特定表型的诊断。如遗传性痉挛性截瘫、脑白质营养不良、CMT等。 （2）重叠疾病表型的诊断。如肌病Panel，虽有重叠表型，但又属于不同疾病类，可用不同Panel检测。再如癫痫，遗传代谢病引起的代谢性癫痫和幼婴癫痫性脑病均以癫痫为主要表现，分属不同类别，且有各自表型特点，也应采用不同Panel检测。 （3）属于同一类致病机制或分子途径的疾病。如离子通道病神经系统疾病进行Panel检测。 Panel检测技术优势：检测基因数目少，使检测成本相对低，数据分析速度快，整体检测周期短。另一显著的优势，在蛋白编码区域能达到很深的测序深度与覆盖度，这对临床诊断来说至关重要，因为高深度意味着准确率高。Panel检测因为是对已知基因进行目标基因检测，最大的局限性就是只能检测Panel内的基因。如果疾病致病基因不在Panel里则不会被检测到，随着疾病的新的致病基因被发现，或对非典型表现的认识程度加深，有些Panel可能会因为基因不全而应用受限，这就需要再重新设计Panel。 二、NGS-全部外显子组捕获方案（WES方案） 全外显子组检测（Whole Exome Sequencing，WES）（上图-左），WES检测不局限于特定选择的基因，范围是人类已知20000多基因的编码区序列，大概是整个基因组的1-2%，但却包含了基因变异的85%。因此，WES检测是在已知基因下针对SNVs这种变异最全面的方案。据研究统计，孟德尔遗传病通过WES检测的阳性率可以达到22%至31%。神经系统疾病用WES检测诊断阳性率（30.6%）比非神经系统遗传病阳性率（如：皮肤系统17.2%、血液系统疾病17.1%）更高。用WES方案检测癫痫或共济失调可以达到总体36.1%的阳性率。
WES检测适用于： （1）表现为遗传异质性疾病的诊断。如自闭症或发育障碍、线粒体疾病，这类疾病常涉及多种表型系列，且致病机制复杂。 （2）一个患者表现出两种或以上的完全独立系统疾病的复杂情况。如：患者既有眼皮肤白化病又有中性粒细胞减少又有癫痫表现，这样患者选择方案时选两个或两个以上的Panel反而会增加成本。 （3）患者全身多系统受累。如：一些综合征类疾病，像Kabuki综合征，表现为特殊面容、骨骼发育障碍、多发畸形等。或Zellweger综合征，表现全身多发畸形、神经系统症状、肝功能和肾功能异常等多种表现。 WES检测优势是全面，是对全部基因的外显子进行检测。相比于Panel，会有更大的发现新致病基因的可能性。可以检测到编码区的VUS变异，用于人类基因组外显子研究非常重要。WES最大的挑战就是数据分析，WES通常有150-200×的测序深度，平均测序深度不低于100×，并且20×深度的基因覆盖度也是数据质量可靠的重要参考指标。 三、NGS-全基因组测序方案（WGS方案） 全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）检测范围最全面，不用捕获，是对整个基因组进行检测，不仅能检测编码区，还可以检测到非编码区以及调控区，以及一些结构变异。但WGS的局限性也是显而易见的。首先，因WGS是对整个基因组检测，会检测到很多内含子和基因间区域内变异，而这些变异的功能在很大程度上是未知的，因此这些被检测的未知数据的分析解读是一个难题。其次，如果保证数据深度（100×）和质量的条件下，WGS会比WES高于3-5倍甚至更高的检测成本。第三，由于数据量的增多，在数据存储、数据分析、数据过滤注释等方面需要建立的方法都要比WES更加复杂。最后，WGS无大样本罕见变异参考，即使检测到的数据，也可能无致病性分析的参考。 检测方案的选择要从患者实际患病情况出发，为患者选择最适合方案以达到精准诊断的目的。有两点选择标准： 一、表型越非特异越应选择相对全面的方案
表型异质性与特异性示意图（Wright CF et.al. Nat Rev Genet. 2018.） 当一个疾病表型很确定时，只需要选择相对明确的直接检测，如图，假如能确定囊性纤维化，只检测CFTR基因即可，应用NGS测序都已属于过度检测。而对于一些非特异性的我们也称为遗传异质性表型，为达到更高阳性检出率必须做相对大而全的方案。 二、Trio模式比先证者模式检测更严谨
先证者模式是只对家系中第一个发现该病的患者（先证者）一个人进行检测，数据分析后有疑似致病性位点，再进行父母或其他患病成员的家系Sanger测序验证。家系模式是对先证者及其父母三个人全部进行NGS测序。Trio模式会提高阳性诊断率，如严重发育障碍患者，先证者模式WES阳性诊断率是28%，Trio-WES的阳性诊断率可以提高至40%，增加了12%的阳性诊断率。这是因为家系模式可以从遗传学上考虑见到更有意义的变异位点，如：De novo突变、纯合突变、复合杂合突变、X连锁疾病半合子突变、单亲二倍体、家系表型-基因型共分离，通过家系筛查可以判断变异致病性，有更强的遗传学证据，同时避免出现先证者模式可能造成的假阳性结果。 随着近年来高通量测序技术的发展，以及测序成本的降低，高通量测序技术已逐步替代经验诊断为主导的单基因测序技术，成为遗传病诊断的主要遗传学检测技术。基于高通量测序技术平台，衍生出不同的检测方案。不同检测方案均有其检测适应症、优势及局限性，在方案选择上要充分考虑患者临床表型，以及疾病与基因相关性进行综合评估，选择能够为患者带来最好诊断效果的检测方案。当下测序技术本身已不是瓶颈，核心关键在于高通量测序后得到的海量数据的数据分析与数据挖掘。运用高通量测序技术，结合生物信息学分析、遗传学分析、临床表型分析等进行多学科综合分析与解读，最终实现对单基因遗传病患者进行精准病因学诊断。
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