临床分子诊断与下一代测序技术

邵阳，多伦多大学医学院癌症基因组学博士，本科毕业以最高荣誉毕业于多伦多大学医学院免疫系并进入硕博连读。在世界最前列的玛格丽特公主医院/安大略省癌症研究院从事癌症基因学研究超过7年，对肿瘤学，基因学以及免疫学有深入的研究。自全基因组时代到来之际，一直致力于全基因组片段及测序研究，主要研究领域为高通量测序技术及大数据分析在癌症及干细胞中的运用。
       在知名学术期刊（Immunity影响因子26.4，Jour.Imm等）上发表多篇论文，并编纂癌症生物学教科书的相关章节（Basic Science of Oncology第五版）。多次在国际学术会议（包括AACR美国癌症研究协会转化医学年会，美国人类基因学会年会，冷泉港亚洲计算生物学年会等）上展示科研成果。已申报下一代癌症基因测序专利5项。获得加拿大国家级及省级科研基金/奖学金12项。

       摘要: 随着分子生物学和生物信息学技术的快速发展，分子诊断逐渐成为检验医学的一个重要组成部分，为临床治疗提供了更为快速和准确的数据支持。下一代测序技术的出现大大提高了测序通量，降低了测序成本，可以准确而全面的分析基因突变情况，为肿瘤个体化治疗提供了一个强有力的工具。本文将就临床分子诊断技术和下一代测序技术及其在肿瘤个体化治疗方面的进展情况进行介绍。
       关键字：分子诊断；下一代测序技术；肿瘤个体化治疗；NGS

       分子诊断是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法研究人体生物大分子体系的存在、结构或表达调控变化，为疾病的预防诊断治疗和预后判断提供信息和决策依据的学科。广义的分子诊断包括基因诊断、蛋白质及多肽检测、抗原与抗体检测等，目前临床开展最广泛的是基于核酸检测的基因诊断。近年来，随着生物芯片、生物传感器、下一代测序技术等多种新型分子生物学技术方法的飞速发展，分子诊断得以为临床提供更为快速和准确的数据服务，并且逐步成为临床实验室的常规应用技术。分子诊断技术可以为肿瘤个体化治疗提供准确的检测信息，包括患者体内遗传物质的结构和表达水平的变化、表观遗传学改变及参与抗肿瘤药物代谢相关基因的结构和表达情况等，这些成为临床个体化医疗的基础，对肿瘤的诊断、预后和治疗效果的预测都具有重要的意义。分子诊断将成为未来检验医学的一个重要的发展方向。
       在分子诊断技术中测序无疑占有十分重要的地位，1977年Sanger发明的末端终止测序法（第一代测序技术）结合毛细管电泳以其简便快速的特点一度成为DNA测序的主流方法被广泛应用于科研和临床工作中。但同时它也有测序通量不大、准确度不高、对不同生物基因组进行测序的代价高昂等难以克服的缺点使其不能完全满足科研的需要。人类第一张基因组图谱的绘制前后共耗时13年时间，花费27亿美元，这显然难以应用于临床检测。人们急需费用更低、通量更高、速度更快的测序技术。近年来，下一代测序技术（nextgeneration sequencing，NGS）发展迅猛，它以高通量的测序技术对现有技术进行了革命性的变革，使测序的高通量、自动化成为现实，能在很短的时间内完成大量测序工作，并且可以通过增加测序覆盖以达到很高的灵敏度和准确度。下一代测序技术通过大规模平行测序的方法大大降低了测序成本和时间，使利用这一技术进行临床检测成为可能，并且具有很大的发展前景。本文将对目前临床常用的常见的分子诊断技术和下一代测序技术进行介绍。

1. 常用的传统临床分子诊断技术

       目前常用的分子诊断技术可以分为聚合酶链式反应（PCR）技术、核酸分子杂交技术、DNA芯片技术和DNA测序技术几类。

1.1 聚合酶链式反应（PCR）技术

       自1983年诞生PCR技术距今已有30年，该技术已成为分子生物学应用最广泛的技术之一。聚合酶链式反应（PCR）技术可以在引物的介导下对特定基因区域进行扩增，因此被广泛用于获取特定基因或基因片段。
       PCR技术的重点在于引物设计、产物分析和信号检测。由检测方法的差异可分为常规PCR和荧光实时定量PCR（real-time PCR），前者在反应终点采用电泳、杂交等方式检测产物，后者则可以实时动态监测。常规PCR用于临床分子检测有较大的局限性：一是不能准确定量，只能进行定性分析；二是由于PCR敏感度高容易形成交叉污染造成检测结果假阳性。实时荧光定量PCR法克服了常规PCR法进入平台期或饱和期后定量的较大误差，实现了DNA/RNA的精确定量，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等特点，并且由于无需开盖检测降低了交叉污染的几率。目前实时荧光定量PCR最具代表性的方法是SYBR法和Taqman法。SYBR法利用荧光染料掺入到核酸双链中使扩增产物携带荧光，通过检测标准品和产物的荧光值即可达到定量的目的，但荧光染料也会掺入到非特异产物中造成误差。Taqman探针法是一种高度特异的定量PCR技术，利用了荧光共振能量转移原理，探针5’端标记有报告基团（reporter）3’端标记有淬灭基团（quencher）。当探针完整时，报告基团发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到荧光信号，随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′→5′核酸外切酶活性就会将探针切断，报告基团与淬灭基团分离，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的拷贝数。该方法在临床有较广泛的应用，可用于分析mRNA表达水平、基因突变和检测基因拷贝数等。
       常规PCR和荧光定量PCR的使用都需要昂贵而精良的仪器设备，从而限制了其在床旁检测的应用。近年来核酸恒温扩增技术的出现解决了这一问题。在过去10多年中已开发出了环介导等温扩增法、链置换扩增法、滚环扩增法、核酸序列依赖扩增法和转录酶扩增法等多种扩增技术。这些不同技术的差别主要在于提供扩增反应延续的动力来源不同。由于该技术操作简便、敏感度高，正逐步被人们所接受。
       随着PCR技术的进步，不断有新的检测手段出现，如高分辨率熔解曲线分析（HRM）。HRM技术主要是基于核酸分子物理性质的不同。不同核酸分子的片段长短、GC含量、GC分布等是不同的，因此任何双链DNA分子在加热变性时都会有自己特异的熔解曲线的形状和位置。HRM技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品进行区分，具有高速简便的特点，为突变筛查和基因分型和SNP检测提供了新方法。
       PCR技术在感染性病原体检测、细菌耐药基因检测等方面有较大发展前景，但该技术也有检测通量低、容易被污染出现假阳性结果等缺点。

1.2 核酸分子杂交技术

       核酸分子杂交技术是检测核酸分子间序列同源性的一种技术。不同来源的核酸单链只要彼此间有一定的互补序列就可以按碱基互补配对规则相结合，杂交可以在DNA与DNA、RNA与RNA、或DNA与RNA之间进行。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，已广泛应用于生物学、医学及临床诊断中。核酸分子杂交可以分为Southern杂交、Northern杂交、原位杂交（ISH）、荧光原位杂交（FISH）和斑点杂交等。其中临床最有代表性的是荧光原位杂交技术（FISH）。
       FISH检测首先利用荧光基团标记DNA探针，再将标记的DNA探针与样本DNA进行原位杂交，最后在荧光显微镜下对荧光信号进行计数，作为诊断的依据。该方法具有操作简便快捷、结果直观、方法敏感的特点，成为应用最广泛的分子杂交技术。用FISH进行检测可以分为样本制备、探针制备和标记、变性、杂交、信号检测和结果分析几个步骤。FISH不仅可以用于单基因或核酸的检测，还进一步扩展到多色多基因同时检测。多元荧光原位杂交和光谱核型分析技术能够一次定位多种基因并用不同的颜色标记24条不同的染色体。同时探针标记、染料开发和图像分析技术的进步不断推动FISH技术的发展。目前该技术的应用主要集中在血液肿瘤诊断、产前诊断、实体瘤诊断和靶向药物治疗等领域。

1.3 DNA芯片技术

       DNA芯片又称为基因芯片、DNA微阵列，是上世纪90年代发展起来的一项新技术。它利用核酸分子碱基互补配对原理，首先通过微加工和微电子技术将大量寡核苷酸探针分子固定在固相支持物上，然后将荧光标记的样本与固化的探针分子进行杂交，通过荧光扫描和分析系统检测每个探针分子的杂交信号强度，进而获得样本的分子数量和序列信息，可以对大量生物信息进行快速的检测和分析。
       DNA芯片的基质一般为经过处理的玻璃、硅片等物质，每个芯片表面都被划分出数量不等的小区，在指定的小区内固定有大量特定功能的探针。DNA芯片的生产集合了分子生物学、高分子化学合成技术、激光技术、微电子技术等多项前沿科学。根据芯片制作技术和功能的不同又可以分为寡聚核苷酸微阵列芯片、微电子芯片和微量点样技术芯片等。DNA芯片的优点是检测通量高，因为传统的一代测序技术测序速度慢不足以解决大量的测序工作，早期DNA芯片主要用来研究基因结构和序列测定工作。随着技术不断发展目前已被应用于基因表达分析、基因突变和基因组多态性检测、基因诊断等多个领域。DNA芯片的缺点在于不能像FISH技术那样对检测基因在细胞或组织中的位置进行精确定位和判断，与测序技术相比容易出现假阳性。

1.4 DNA测序技术

       作为分子诊断的金标准DNA测序分析一直被广泛应用于各种遗传病检测、个体化治疗及用药和多基因疾病的诊疗上。
       第一代测序技术主要基于Sanger 1977年发明的双脱氧核糖核酸链末端终止法结合半自动化毛细管电泳技术。其原理是在DNA复制过程中掺入ddNTP，由于ddNTP缺乏延伸所需的3’-OH基团可使反应终止，就会产生一系列末端终止的DNA链，对每种ddNTP进行不同颜色的荧光标记，调整dNTPs和ddNTPs的相对浓度就可以获得一组长短相差一个碱基的DN**段，这些DN**段具有相同的起点，但终止在不同的核苷酸上。接着，再用高分辨率的毛细管凝胶电泳分离这些延伸产物，通过对延伸产物末端四种不同荧光颜色的区分，计算机软件就会自动识别出DNA序列。这一方法的缺点是操作步骤繁琐、测序通量低导致对测序规模的限制以及成本高昂，在临床诊断中较难应用。

2. 下一代测序技术（NGS）

       由于可以极大地提高测序效率，近年来下一代测序技术（NGS）的发展十分迅速，大规模测序平台已经逐渐发展成为主流测序技术。这项技术的出现不仅使单位DNA测序的费用降到了之前的百分之一，也使测序时间大大减少，这让越来越多的科研人员可以参与到基因组测序的工作中来。
       虽然现在市面上的下一代测序仪产品有很多，但大多数产品所基于的原理和技术是类似的。首先将基因组DNA随机打断成一定大小的小片段DNA，然后在体外给这些小片段DNA加上接头成为文库，再通过桥式PCR、原位polony或微乳液PCR获得测序模板。它们都需要通过PCR形成空间上聚集的扩增产物，不同的是桥式PCR和原位polony法使用的是平面载体，微乳液PCR则是在微球的表面进行的。下一代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis），即通过捕捉新合成核苷酸的末端标记来确定DNA序列，使用聚合酶或连接酶不断地延伸引物，对每一轮反应的结果进行荧光图像采集和分析，获得序列结果。
       目前市场上主流的二代测序仪有：Roche公司454测序仪、ABI公司的SOLiD测序仪、Illumina公司Solexa基因组分析仪和Life Technologies公司的Ion Torrent测序仪等。

2.1 Roche公司454测序仪

       454生命科学公司开创了边合成边测序技术，并首先将焦磷酸测序应用在二代测序技术上。454公司及随后的Roche公司推出的GS FLX system基于乳胶系统PCR（emulsion PCR）和焦磷酸测序技术。测序时首先将基因组DNA剪切成300bp-800bp大小的DN**段并在两端加上接头（adaptor），通过接头与磁珠相连，测序反应就在固相磁珠上进行。将PCR所需的酶和磁珠加入矿物油中，形成的水滴被矿物油包裹形成了油包水的乳胶结构，每一个液滴就是一个独立的微反应器。由于每个液滴系统内只包含一条DNA模板，因此PCR后形成的大量拷贝也结合在磁珠上形成一个克隆集落。焦磷酸测序反应在磁珠上进行，测序仪通过检测dNTP聚合时释放的荧光信号达到测序的目的。
       454 GS FLX测序系统的优势在于能够对超过400bp的DN**段样本进行测序，适合进行新物种基因组测序、转录组测序和宏基因组研究等。这种测序方法的主要误差来自于相同碱基的连续插入（如AAAA），在这种情况下碱基长度只能从信号强度进行推测，这可能产生误差，因此产生的错误类型主要是插入和缺失。由于该设备和测序成本较高限制了它的市场化普及。

2.2 ABI公司SOLiD测序仪

       ABI公司推出的SOLiD系统使用连接酶合成测序技术取代了聚合酶延伸反应，它以4种荧光标记的寡核苷酸连续反应为基础。该系统创新使用了双碱基编码技术，在测序过程中对每个碱基判读两次，减少了原始数据的错误，加上连接反应没有聚合酶合成中的错配问题，因此SOLiD系统在下一代测序仪中的准确度是最高的。
       测序之前的文库构建和乳化PCR扩增与GSFLX系统类似，但SOLiD使用的微珠更小只有1μm左右。连接测序的底物是8bp的荧光探针混合物，样本DNA根据序列位置被探针标记。由于连接酶优先连接和模板配对的探针并引发荧光信号，测序完成后就可以通过位置的颜色信息推断出相应的碱基序列。
       SOLiD的读长只有50-75bp，原始碱基数据的精确度大于99.94%，并且可以非常方便的区分SNP和测序错误，其主要特点是高通量和高准确度，比较适合基因组重测序和SNP检测。

2.3 Illumina公司Solexa基因组分析仪

       Illumina公司的Solexa测序仪是目前二代测序仪市场占有率最高的一款产品，核心专利是DNA簇（DNA cluster）和可逆性末端终止。这款测序仪适用于采用各种方法制备的DNA文库，使用文库中的DN**段可达数百bp。
       测序时首先将经过剪切的DN**段的两端加上接头并通过碱基互补结合固定在芯片表面，使用引物扩增后将双链变性为单链后该单链的一端就固定在芯片上，另一游离端可随机与附近另外一个引物互补结合，也被固定形成一个桥（bridge）。用引物PCR后每个DN**段大约获得1000倍扩增，形成单克隆的DNA簇群。Illumina测序仪使用的桥式PCR与传统桥式PCR不同，它交替使用Bst聚合酶进行延伸反应和甲酰胺进行变性反应。可逆末端终止是指在荧光标记的dNTP 3’-羟基末端带有可被化学切除的基团，这些基团能够封闭3’末端使每轮反应只允许掺入单个碱基，采集信号后就可以通过化学方法切除封闭基团和荧光基团，进入下一轮反应，如此反复，直到测序完成。Illumina测序仪最初的测序长度较短，后逐渐增加到200bp以上。可逆终止的设计保证了在延伸过程中每次掺入单个碱基，因此出现的错误类型主要是碱基替换。该测序仪被广泛应用于全基因组和目标基因组测序、表观基因组学、转录表达谱中。

2.4 Life Technologies公司的Ion Torrent测序仪

       Ion Torrent测序仪使用了革新性的半导体芯片技术，使整个平台具有很高的扩展性和快速测序的能力，更适合于小规模基因组测序。其核心技术是利用特有的大规模并行半导体感应器直接将DNA扩增时产生的化学信号转换为数字信号，是第一款不需要光学系统的商业测序仪。
       该测序仪的原理是利用DNA聚合酶进行DNA链延伸时每掺入一个碱基就会释放一个质子，导致局部可被检测的PH变化。每个Ion Torrent的半导体微孔测序芯片中的微球表面包含约100多万个DNA分子拷贝，测序时一个一个的核苷酸分子连续流过芯片微孔，如果模板DNA分子上的一个互补核苷酸被合成，就会释放一个氢离子，该微孔内的PH值发生变化。离子传感器可以监测到这种变化并马上把这种化学信息转化为数字电子信号，如果DNA链上有两个相同的碱基则可以检测到双倍的电压，仪器记录两个相同的碱基。如果核苷酸不匹配则不能检测到电压，也不记录碱基。这种方法不需要使用CCD扫描或照相的方法检测荧光信号，因此检测时间大大缩短，只需几秒钟就可以检测新插入的碱基。
       与其他二代测序仪相比，Ion Torrent测序仪的优势主要在于强大的扩展能力和更短的测序时间。它使用2个小时就能完成其他二代测序仪几天才能完成的工作。
       在临床诊断方面，下一代测序技术拥有其他检测方法所不具备的灵敏精确、成本低、通量大等优势。但用这种方法耗时相对较长，另外由于其需要分析的数据量巨大，后期要克服处理大量序列信息的障碍，并进行复杂的生物信息学处理。

3. 下一代测序技术在肿瘤个体化治疗中的应用

       下一代测序技术发展迅速，其应用非常广泛，包括细菌和病毒基因组的测序；全基因组或基因目标区域的重测序寻找遗传突变；通过检测基因表达变化解释遗传调控机制等。在这里我们将主要介绍在肿瘤个体化分子靶向治疗中的作用。
       肿瘤的发生与发展是一个复杂的过程，其本质是基因突变，DNA、RNA以及表观修饰水平上发生的基因变异在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。大部分肿瘤是由多种突变合力造成的，同一种癌症有可能是由完全不同的致癌基因引起的。因此癌症的治疗需要从基因检测入手，先了解是哪些基因发生了突变，再选择最有效的治疗方案和药物。现代研究表明，不同个体的遗传性差异会导致对药物有效性和耐受性的差异，而这一点对于分子靶向药物而言尤为明显。对肿瘤患者进行基因突变检测，可以对靶向治疗的效果进行预测，提高治疗的准确性，为医生临床用药提供参考，给病人节省宝贵的时间和费用。比如BRCA1/BRCA2是负责对DNA损伤进行修复的基因，突变会导致乳房和卵巢肿瘤，对有家族病史的高危人群进行BRCA1/BRCA2基因突变检测可以判断是否需要提前进行病理检查或预防性治疗，降低患癌概率。吉非替尼和埃罗替尼作为非小细胞性肺癌治疗的二线药物要在使用前检测EGFR突变情况，同时还要考虑KRAS基因突变及MET扩增的影响，也是因为不同的突变对个体用药的疗效有明显差异。
       因此，对肿瘤进行全面、系统的分析是实现个体化治疗的基础，利用下一代测序技术获得肿瘤序列突变信息是临床诊断的关键。NGS的高通量测序可以完成对整个或局部基因组的分析，在检测DNA点突变、基因拷贝数改变及基因重组（染色体移位）等方面具有强大的能力。同时NGS所具备的样本需求量少、灵敏度高、自动化等特点特别适合分析肿瘤基因组变异。
       虽然目前下一代测序技术依然有检测时间较长、数据分析复杂、设备及试剂价格昂贵、存在单碱基误差等缺点。但是随着技术的快速发展，测序成本和测序时间必然会进一步降低，准确性大幅提高。NGS用于临床个体化诊疗的优势将更好的展现在人们面前。